心腦舒通及其單體成分對小鼠腦微血管內皮細胞缺氧復氧炎癥損傷的影響

袁 慶 柴麗娟 王少峽 郭 虹 趙 莼 徐楊楊 馬萌萌 王喬悅 胡利民

(天津中醫藥大學 天津市中藥藥理學重點實驗室 省部共建方劑學教育部重點實驗室，天津 300193)

Theanti-inflammatoryeffectofXinnaoshutonginhypoxiaandreoxygenationmousebrainmicrovascularendothelialcells

YUANQing,CHAILi-Juan,WANGShao-Xia,etal.

TianjinKeyLaboratoryofChineseMedicinePharmacology,KeyLaboratoryofPharmacologyofTraditionalChineseMedicalFormulaeMinistryofEducation，TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300193,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of Xinnaoshutong and its monomer component on the inflammatory cytokines TNF-α, IL-6, IL-1β in cerebral ischemia and reperfusion mouse brain microvascular endothelial cells line bEnd.3.MethodsIschemia-reperfusion inflammation injury bEnd.3 cells model was established, the effect of different concentrations Xinnaoshutong (0.1,1.0,10.0,50.0 μg/ml) or the monomer component(10μmol/ml) on cells vitality of bEnd.3 was detected. Inflammation-related factor TNF-α, IL-6, IL-1βlevel were measured by ELISA.ResultsXinnaoshutong significantly inhibited bEnd.3 cell cytoplasmic synthesis of TNF-α, while the supernatants of IL-6 secretion was inhibited but there was no statistical difference. The cytoplasmic synthesis or supernatants of IL-1β expression in bEnd.3 cells was not obvious.ConclusionsXinnaoshutong plays a therapeutic role in inflammatory injury of cerebral ischemia by inhibiting the synthesis inflammatory cytokines of TNF-α.

【Keywords】 Xinnaoshutong; Cerebral ischemia and reperfusion; Inflammatory cytokines; TNF-α; IL-6

腦缺血后的強烈炎癥反應是造成腦組織繼發性損傷的因素之一，在此炎癥反應的過程中，有多種因素相互作用，共同引起了再灌注損傷，并且以其預后差，死亡率高而日益引起人們的關注〔1〕。 心腦舒通膠囊是由中藥蒺藜屬植物蒺藜干燥的地上全草提取物而制成的膠囊劑，以蒺藜總皂甙為其主要成分，具有活血化瘀、祛痰化濕、補益肝腎等功效〔2～4〕。現代藥理學研究表明，其具有改善微循環，選擇性增加腦缺血部位的供血及提高抗氧自由基等作用〔5〕。但其在腦缺血再灌注炎癥損傷中發揮作用的研究較少。本實驗旨在考察心腦舒通及其單體成分對缺氧復氧合并腫瘤壞死因子(TNF)-α刺激損傷后bEnd.3(小鼠腦微血管內皮細胞)炎癥相關因子TNF-α、白細胞介素(IL)-6、IL-1β釋放的影響，初步探討心腦舒通抗腦缺血再灌注炎癥損傷的機制。

1 材料與方法

1.1材料 bEnd.3細胞株(ATCC，美國)，DMEM培養基(Corning，美國)，FBS(BI，美國)，心腦舒通(吉林敖東股份有限公司，中國)，化合物5：(26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25R)-5α-呋甾-20(22)-烯-3β，26-二醇-3-O-{β-D-吡喃木糖基-(1→2)-〔β-D-吡喃木糖基-(1→3)〕-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-〔α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)〕-β-D-吡喃半乳糖苷})、原薯蕷皂苷(由天津中醫藥大學中醫藥研究院張鵬老師提供)，無糖KRP(250 ml含NaCl 2.25 g/KCl 0.105 g/NaH2PO4·2H2O 0.032 5 g/ Na2HPO4·12H2O 0.180 25 g/MgSO40.067 5 g/CaCl20.081 g)，高糖KRP(在無糖KRP基礎上加葡萄糖1.125 g)，CCK-8 (CCK-8，Dojindo，日本)，TNF-α(R&D，美國)，TNF-α試劑盒、IL-6試劑盒、IL-1β試劑盒(北京四正柏)，37℃飽和濕度培養箱(Thermo，Forma3111型，美國)，倒置相差顯微鏡(Nikon，TE200，日本)，多功能讀板機(TECAN公司，瑞士)，低溫高速離心機(Beckman，64R型，美國)。

1.2bEnd.3細胞的培養 bEnd.3細胞培養于DMEM+20%FBS+1%雙抗的培養液中，隔天換液，每5天用0.25%的胰酶消化傳代，置5%CO2、37℃飽和濕度培養箱中培養。

1.3不同造模條件對bEnd.3細胞TNF-α、IL-6的影響 將傳代的細胞接種到24孔板內生長至融合，對照組換成高糖KRP，置5%CO2、37℃飽和濕度培養箱中培養。模型組換成無糖KRP，在缺氧小室(94%N2+5%CO2+1%O2)中培養4 h，復氧時對照組換不含FBS的DMEM培養，模型組換含不同濃度的TNF-α(10、20、40 ng/ml)的DMEM，置5%CO2、37℃飽和濕度培養箱中培養。IL-6檢測分別于復氧1 d、2 d、3 d收集上清，用鼠IL-6 ELISA試劑盒檢測。TNF-α檢測：分別于復氧1 d、2 d、3 d用220 μl細胞裂解液(10 ml TBS中含20 μl Triton X-100，20 μl甘油)冰上振搖處理10 min收集胞質裂解液，用鼠TNF-α ELISA試劑盒檢測量(參照ELISA試劑盒說明書)。

1.4心腦舒通對正常培養的bEnd.3細胞活力的影響 取生長狀態良好的bEnd.3細胞經0.25%的胰酶消化后制成單細胞懸液，接種到96孔板，置5%CO2、37℃飽和濕度培養箱中培養，而后加入含有不同濃度心腦舒通(0.1、1.0、10.0、50.0 μg/ml)或單體(10.0 μg/ml)的DMEM培養基進行培養，24 h用CCK-8檢測細胞活力。

1.5心腦舒通對缺氧再灌及炎癥損傷的bEnd.3細胞活力的影響 取生長狀態良好的bEnd.3細胞經0.25%的胰酶消化后制成單細胞懸液，接種到96孔板，置5%CO2、37℃飽和濕度培養箱中培養至細胞融合后，進行細胞缺氧再灌及炎癥損傷，考察心腦舒通及其單體成分對bEnd.3細胞活力的影響，細胞分組如下：對照組：將細胞培養液置換為高糖KRP溶液4 h，而后換成正常無血清DMEM培養液培養，置5%CO2、37℃飽和濕度培養箱中培養20 h。模型組：將細胞培養液置換為無糖KRP溶液4 h，而后換成含TNF-α(40 ng/ml)無血清DMEM培養液培養，置5%CO2、37℃飽和濕度培養箱中培養20 h。不同濃度加藥組：將細胞培養液置換為無糖KRP溶液4 h，而后換成含不同濃度心腦舒通(0.1、1.0、10.0、50.0 μg/ml)或單體成分(10.0 μg/ml)的含TNF-α(40 ng/ml)無血清DMEM培養液培養，置5%CO2、37℃飽和濕度培養箱中培養20 h。用CCK-8 試劑盒檢測細胞活力。

1.6心腦舒通對缺氧再灌及炎癥損傷的bEnd.3細胞胞質TNF-α的影響 將傳代的細胞接種到24孔板內生長至融合，實驗分組及細胞處理同上，復氧3 d后用磷酸鹽緩沖液(PBS)將細胞洗兩遍，加入細胞裂解液冰上振搖處理10 min，收集胞質裂解液，用鼠TNF-α ELISA試劑盒檢測TNF-α量。

1.7心腦舒通對缺氧再灌及炎癥損傷bEnd.3細胞IL-6、IL-1β的影響 將傳代的細胞接種到24孔板內生長至融合，實驗分組及細胞處理同上，復氧3 d后收集細胞上清，用鼠IL-6、鼠IL-1β ELISA試劑盒檢測。

1.8統計學方法 采用SPSS18.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1不同濃度TNF-α對bEnd.3細胞TNF-α合成、IL-6分泌的影響 不同濃度TNF-α均能誘導bEnd.3細胞胞質TNF-α、上清IL-6的合成，且具有劑量依賴性。隨著復氧時間的延長，胞質TNF-α和上清IL-6的分泌逐漸升高，故研究確定TNF-α的刺激濃度40 ng/ml，復氧時間定為3 d(表1)。

表1 不同造模條件對bEnd.3細胞TNF-α合成及IL-6分泌的影響

與前一TNF-α濃度組比較：1)P<0.05

2.2心腦舒通對正常bEnd.3細胞活力的影響 與對照組相比，心腦舒通各濃度組及單體成分對正常培養bEnd.3細胞活力沒有影響，說明所采用濃度無細胞毒作用，并且不同濃度心腦舒通能顯著促進bEnd.3細胞的增殖(P<0.05)，見表2。

2.3心腦舒通對缺氧再灌及炎癥損傷的bEnd.3細胞活力的影響 與對照組相比，模型組能顯著抑制bEnd.3細胞的增殖(P<0.05)；與模型組比較，心腦舒通(0.1、1.0 μg/ml)及其單體成分對缺氧再灌及炎癥損傷的bEnd.3細胞活力恢復作用具有顯著性差異(P<0.05)，心腦舒通10.0、50.0 μg/ml組能恢復細胞活力但差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.4心腦舒通對缺氧再灌及炎癥損傷bEnd.3細胞TNF-α合成量的影響 與對照組相比，模型組能顯著刺激bEnd.3細胞胞漿炎性因子TNF-α合成量(P<0.05)；與模型組比較，心腦舒通(0.1、1.0、10.0 μg/ml)及其單體成分能有效抑制缺氧再灌及炎癥損傷的bEnd.3細胞胞質炎性因子TNF-α合成，差異有統計學意義(P<0.05)，心腦舒通50.0 μg/ml組差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

2.5心腦舒通對缺氧再灌及炎癥損傷bEnd.3細胞IL-6釋放量的影響 與對照組相比，模型組能顯著刺激bEnd.3細胞上清炎性因子IL-6釋放量(P<0.05)；與模型組比較，心腦舒通及其單體成分對缺氧再灌及炎癥損傷的bEnd.3細胞上清炎性因子IL-6釋放有降低作用，但差異無統計學意義(P>0.05)。單體成分化合物5抑制作用有顯著差異(P<0.05)，見表3。

表2 心腦舒通對正常及模型損傷bEnd.3細胞活力的影響

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較: 2)P<0.05,下表同

表3 心腦舒通對模型損傷bEnd.3細胞TNF-α合成量及IL-6釋放量的影響

2.6心腦舒通對缺氧再灌及炎癥損傷bEnd.3細胞IL-1β的影響 不同濃度TNF-α合并缺氧復氧刺激bEnd.3細胞，其合成及分泌IL-1β均非常少不以此作為模型選擇依據。

3 討 論

腦缺血再灌注過程中局部炎癥因子、趨化因子及黏附分子的表達上調構成了缺血性損傷向炎癥性損傷轉變的基礎，隨后白細胞向缺血區聚集和浸潤，穿越血腦屏障進入腦實質，從而引起了腦缺血再灌注后炎癥反應〔6〕。TNF-α是最重要的炎癥因子，具有廣泛的生物學效應〔7〕，能通過促進凝血、增加內皮細胞通透性及誘導黏附分子或其他炎性介質TNF-α、IL-6 等多種炎癥因子的表達，從而引起一系列的炎癥反應，加重腦缺血再灌注損傷〔8～10〕。本實驗過程選擇缺氧復氧合并TNF-α模型模擬腦缺血再灌注損傷的早期炎癥反應〔11，12〕，通過檢測局部炎癥因TNF-α、IL-6、IL-1β，初步評價心腦舒通的抗炎作用及腦保護作用。

本實驗結果顯示，在不影響細胞活力的情況下，心腦舒通各濃度組及單體成分均能較好地抑制炎癥因子TNF-α的釋放。劉雪梅等〔13～15〕在其實驗研究中表明腦缺血再灌注后大鼠的血清和腦內TNF-α和IL-1β大量表達，神經細胞凋亡數量顯著增加，且組織結構疏松，尼氏小體明顯減少，神經元丟失嚴重，而心腦舒通膠囊能有效抑制炎性因子TNF-α和IL-1β表達，降低神經細胞凋亡數量，從而保護受損的腦組織。本實驗中也發現心腦舒通能降低小鼠腦微血管內皮細胞TNF-α的表達量，與其在體實驗結果一致，進一步說明心腦舒通有效抑制炎性因子TNF-α的表達可能是其治療腦缺血再灌注炎癥損傷的途徑之一。IL-1β是血漿和組織液中的主要形式，同時也是腦組織中的主要形式，參與了早期的炎癥反應，IL-1β能夠刺激黏附分子及誘導其他的炎性介質產生，促進炎癥反應，而腦缺血再灌注可以誘導IL-1β的產生〔16〕。而本實驗對炎癥因子IL-1β的作用結果顯示，不同復氧時間點及不同濃度TNF-α刺激后模型組與對照組均無統計學差異，其原因可能是由于IL-1β在bEnd.3細胞中的表達量較少所致。

IL-6是一種促炎癥細胞因子，有研究表明，局灶性腦缺血再灌注損傷后的大鼠腦組織和外周血中均能觀察到IL-6的高表達，說明IL-6參與了腦缺血再灌注損傷〔17〕。 IL-6是某些自身免疫性疾病中的關鍵炎癥因子，與許多疾病的發生和轉歸都密切相關〔18，19〕。有研究表明，IL-6的表達量與炎癥反應程度呈正相關，可以作為判斷炎癥損傷的靈敏指標〔20，21〕。本實驗結果顯示模型組IL-6的表達量呈明顯上升趨勢，說明IL-6參與了此炎癥損傷反應過程。心腦舒通各濃度組及單體原薯蕷皂苷對炎癥因子IL-6的表達有降低趨勢，但未達到顯著性差異。但其單體成分化合物5對IL-6的抑制具有顯著性差異，說明心腦舒通對IL-6的表達有一定的抑制作用。 本研究表明心腦舒通能有效抑制缺氧再灌及炎癥損傷bEnd.3細胞TNF-α、IL-6的表達，提示其對缺血再灌注損傷的早期炎癥反應有一定的抑制作用而發揮腦保護作用。