枸櫞酸鉀對大鼠腎草酸鈣結石形成的影響

劉 英 王志勇 楊德慧 劉曉偉 高旭紅 徐 輝

(承德醫學院附屬醫院泌尿外科，河北 承德 067000)

泌尿系結石復發率高，成因和機制尚不十分清楚，草酸鈣結石是泌尿系結石的最常見成分，腎小管上皮細胞損傷可能為腎草酸鈣結石形成的基礎病變，在某些因素的作用下，腎小管上皮受到損傷，有利于結石成分附著，且變性壞死細胞調入腎小管管腔內有利于晶體的異相成核。枸櫞酸是尿石癥形成的抑制物質，升高尿中枸櫞酸濃度對尿石癥具有防治作用〔1〕。Tamm-Horsfall蛋白是一種大分子有機物，和尿石癥的形成關系密切〔2〕。本文對枸櫞酸鉀對大鼠腎草酸鈣結石形成的影響進行研究，并觀察其對腎組織Tamm-Horsfall蛋白表達強度的影響，探討枸櫞酸鉀防治腎草酸鈣結石形成的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物：清潔級、雄性、成年SD大鼠27只，體重190～240 g，購自北京隆安實驗動物養殖中心，許可證號：SYXK(京)2014-0040。

主要藥品和試劑：乙二醇、氯化銨(湖南匯虹試劑有限公司)，枸櫞酸鉀(上海化學試劑采購供應站)，羊抗兔ABC染色系統試劑盒、Tamm-Horsfall多克隆抗體(美國Sigma公司)等。

1.2實驗方法

1.2.1分組 27只大鼠根據隨機數字法隨機分為枸櫞酸鉀組、腎結石組和對照組，每組9只。對照組大鼠喂普通飲用水，腎結石組喂0.5%氯化銨和0.5%乙二醇混合液致石劑，枸櫞酸鉀組喂上述致石劑的同時給予25%枸櫞酸鉀液(1 ml/100 g灌胃，1次/d)，腎結石組和對照組給予等量飲用水灌胃，共14 d。14 d后留取24 h尿液進行尿鈣離子和尿草酸濃度測定。下肢靜脈采血5 ml進行血生化指標檢測，然后麻醉大鼠打開腹腔，暴露腎臟，取雙側腎臟進行HE染色和免疫組化染色檢驗。

1.2.224 h尿鈣離子和尿草酸濃度測定 24 h尿鈣離子濃度采用全自動生化儀測定；24 h尿草酸濃度采用鉻酸鉀氧化甲基紅催化光度法測定。

1.2.3血生化指標測定 血肌酐、血尿酸、血尿素氮均采用全自動生化儀進行測定。

1.2.4草酸鈣結晶分級評分及腎組織HE染色 光鏡下觀察腎小管草酸鈣結晶情況并進行評分；將腎臟組織切片后進行常規HE染色，觀察腎小管草酸鈣結晶形成情況，并在光鏡下對腎小管草酸鈣結晶沉積進行分級：0級沒有草酸鈣結晶；Ⅰ級有細小結晶但不成堆；Ⅱ級草酸鈣結晶變大成堆，但相互之間不連接；Ⅲ級草酸鈣結晶之間相互連接；Ⅳ級草酸鈣結晶廣泛成堆，連接成片。

1.2.5腎組織Tamm-Horsfall蛋白表達測定 采用免疫組化法測定大鼠腎組織Tamm-Horsfall蛋白表達，以腎組織Tamm-Horsfall多克隆抗體為一抗，設立陰性對照組〔以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗〕，顯微鏡下觀察腎組織Tamm-Horsfall蛋白表達強度，其中淡黃色(輕度染色)為“+”，棕黃色(中度染色)為“”，棕褐色(深度染色)為“”。

1.3統計學方法 采用SPSS20.0軟件，正態分布多組均數比較采用方差分析，組內兩兩比較采用LSD檢驗，腎內結晶評分采用非參數Mann-WhitneyU檢驗；三組腎組織Tamm-Horsfall蛋白表達強度比較采用非參數Kruskal-Walls檢驗，組內兩兩比較采用非參數Mann-WhitneyU檢驗，Tamm-Horsfall蛋白表達等級與腎結石相關性采用kendall tau-b等級相關系數分析。

2 結 果

2.1三組大鼠24 h尿鈣離子和尿草酸濃度比較 三組大鼠24 h尿鈣離子和尿草酸濃度比較差異具有統計學意義(P<0.05)，其中枸櫞酸鉀組和腎結石組24 h尿鈣離子和尿草酸濃度均高于對照組(P<0.05)，腎結石組24 h尿鈣離子和尿草酸濃度高于枸櫞酸鉀組(P<0.05)。見表1。

表1 三組24 h尿鈣離子和尿草酸濃度比較

與枸櫞酸鉀組比較：1)P<0.05；與腎結石組比較：2)P<0.05；下表同

2.2三組血生化指標比較 三組血肌酐、血尿酸、血尿素氮比較差異均具有統計學意義(P<0.05)，其中腎結石組血肌酐、血尿酸、血尿素氮水平均高于枸櫞酸鉀組和對照組(P<0.05)，枸櫞酸鉀組血尿酸高于對照組(P<0.05)，枸櫞酸鉀組血肌酐和血尿素氮與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 三組血生化指標比較

2.3三組大鼠腎草酸鈣結石HE染色 對照組大鼠腎小管未見草酸鈣結晶，腎小管結構正常；腎結石組大鼠多數腎小管內見草酸鈣結晶，腎小管擴張；枸櫞酸鉀組部分腎小管內見草酸鈣結晶，腎小管擴張，但均較腎結石組輕。

2.4枸櫞酸鉀組和對照組草酸鈣結晶分級評分比較 對照組腎小管無草酸鈣結晶形成，枸櫞酸鉀組草酸鈣結晶分級得分(0.61±0.43)顯著低于腎結石組(1.52±0.94，Z=15.253，P<0.05)。

2.5三組腎組織Tamm-Horsfall蛋白表達強度比較 三組Tamm-Horsfall蛋白均在腎小管亨氏攀和遠曲小管表達，三組之間Tamm-Horsfall蛋白表達強度比較差異具有統計學意義(P<0.05)，其中枸櫞酸鉀組平均秩次為14.11，腎結石組平均秩次5.89，對照組平均秩次為22.00，腎結石組Tamm-Horsfall蛋白表達強度低于枸櫞酸鉀組和對照組(P<0.05)，枸櫞酸鉀組Tamm-Horsfall蛋白表達強度顯著高于腎結石組(P<0.05)。見表3。

表3 三組腎組織Tamm-Horsfall蛋白表達強度比較(n,n=9)

2.6Tamm-Horsfall蛋白表達與腎結石形成的關系 Tamm-Horsfall蛋白表達等級與腎結石形成呈負相關(r=-0.827，P=0.000)。

3 討 論

大鼠草酸鈣結石模型的建立有多種方法，包括乙二醇法、草酸鹽法、乙醇酸法、葡萄糖酸鈣法等，這些方法均可增加尿中草酸鹽濃度〔3～5〕，而草酸鈣結石形成的最危險因素即為草酸鹽，乙二醇為草酸前體，重復性好，形成結石穩定，且價格低廉。本文表明乙二醇能夠成功建立大鼠草酸鈣結石模型。

枸櫞酸鹽是結晶抑制劑和絡合劑，能夠增加尿液pH值，是尿液堿化劑，使尿酸溶解度增加，促進尿結石排除，對于泌尿系統酸性結石的治療效果更佳，是常用的泌尿系統結石治療藥物〔6,7〕。本研究結果發現，枸櫞酸鉀對腎草酸鈣結石的形成有抑制作用。高草酸尿和高鈣尿是草酸鈣結石的主要誘發因素，高鈣尿可以造成草酸鈣過飽和形成泌尿系結石；高草酸尿對腎細胞有毒性作用，當腎上皮細胞在草酸中暴露時，腎上皮細胞的活性受到影響，草酸還可引起細胞線粒體功能變化，從而引起上皮細胞壞死和凋亡，促進結晶黏附，并促進結晶的核化和生長〔8〕。本研究結果發現：枸櫞酸鉀能夠降低尿中鈣離子和尿草酸濃度，考慮枸櫞酸和尿中的鈣離子結合形成枸櫞酸鈣，降低尿中鈣離子濃度和草酸鈣飽和度，從而抑制了草酸鈣結晶的形成。

腎臟具有多種功能，血肌酐、血尿酸、血尿素氮是反映腎臟功能的重要指標，肌酐為肌酸的終末產物，肌酸量和肌肉量關系密切，兩者呈正比，正常情況下，肌酐的產生速度比較穩定，并釋放入血；尿素為蛋白質的代謝產物，腎臟為尿素的主要排泄器官。當腎臟受到損害時，血清肌酐、尿酸、尿素氮水平升高〔9～11〕。本研究結果發現，腎草酸鈣結石大鼠的腎臟功能明顯受到損害，而枸櫞酸鉀灌胃可以降低血肌酐、血尿酸、血尿素氮水平，有利于腎臟功能的恢復。

Tamm-Horsfall蛋白是泌尿系統結石形成的重要抑制因子，是尿液中含量最多的蛋白質之一，和泌尿系結石的形成關系密切〔12,13〕。本研究結果發現，正常大鼠腎組織中Tamm-Horsfall蛋白表達等級比較高，腎結石組大鼠腎組織Tamm-Horsfall蛋白表達等級比較低，枸櫞酸鉀可以升高腎草酸鈣結石大鼠腎組織中Tamm-Horsfall蛋白表達等級。Tamm-Horsfall蛋白在枸櫞酸離子的作用下聚集傾向減弱，抑制結晶聚集、生長、成核作用增強。Tamm-Horsfall蛋白表達等級越高，腎草酸鈣結石的形成越少；Tamm-Horsfall蛋白表達等級越低，腎草酸鈣結石形成越多。因此，考慮枸櫞酸鉀抑制腎草酸鈣結石形成的機制可能和枸櫞酸鉀能夠增加Tamm-Horsfall蛋白表達量有關。