美滿霉素對阿爾茨海默病大鼠前額葉皮層CRMP-2和Caspase-3表達的影響

孫縵利 鄧海峰 馬 玲 王興紅 常全忠

(漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校,河南 漯河 462000)

阿爾茨海默病(AD)是一種以進行性認知障礙和記憶力損害為主要表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。研究發(fā)現(xiàn)細胞凋亡在AD的發(fā)生、發(fā)展過程中起決定性作用〔1〕。腦衰反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(CRMP)-2是調(diào)節(jié)突觸發(fā)育的重要分子，能夠促進神經(jīng)元軸突和樹突的生長〔2〕。研究報道，增加CRMP-2的磷酸化水平可以導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡〔3〕。半胱天冬酶家族(Caspase)能夠啟動和維持細胞凋亡，而其成員Caspase-3是該細胞凋亡通路下游最重要的凋亡蛋白酶，其表達量直接反映細胞凋亡程度〔4〕。美滿霉素是一種半合成的第二代四環(huán)素衍生物，安全性高，容易透過血腦屏障到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)〔5〕。大量研究表明美滿霉素可以通過抑制小膠質(zhì)細胞激活、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等途徑保護神經(jīng)細胞進而發(fā)揮腦保護功能，是一種有效的神經(jīng)保護劑〔6，7〕。本文前期實驗也表明美滿霉素可以通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細胞凋亡改善AD認知障礙〔8〕。美滿霉素對細胞凋亡的抑制是否和CRMP-2通路有關(guān)，目前國內(nèi)外很少報道。本實驗擬探討美滿霉素對AD大鼠的腦保護作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 Morris水迷宮裝置(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制)；DW-5大鼠腦立體定位儀(成都泰盟科技有限公司)；美滿霉素膠囊(100 mg/粒，中國惠氏制藥有限公司)；青霉素(哈藥集團)；兔多克隆抗體CRMP-2、兔多克隆抗體p-CRMP-2(Thr514)、兔多克隆抗體Caspase-3均購自Abcam公司；山羊抗兔二抗購自碧云天生物技術(shù)公司；Aβ25～35、戊巴比妥鈉購自Sigma公司。

1.2動物分組及給藥 48只健康雄性SD大鼠(體質(zhì)量240～260 g)由河南省實驗動物中心提供，均在自然光暗周期的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由覓食、飲水。隨機分成對照組、模型組和美滿霉素組。對照組：常規(guī)飼養(yǎng)2 w后，側(cè)腦室注射生理鹽水2 μl，術(shù)后腹腔內(nèi)注射生理鹽水10 ml·kg-1·d-1；模型組：常規(guī)飼養(yǎng)2 w后，側(cè)腦室注射Aβ25～352 μl，術(shù)后腹腔注射同對照組；美滿霉素組：常規(guī)飼養(yǎng)1 w后，腹腔注射美滿霉素50 mg·kg-1·d-1，劑量10 ml/kg，第2周末側(cè)腦室注射Aβ25～352 μl，術(shù)后繼續(xù)腹腔注射美滿霉素50 mg·kg-1·d-1。

1.3AD模型的制備 凝聚態(tài)Aβ25～35制備：用二甲基亞砜50 μl溶解0.1 mg Aβ25～35，再用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)50 μl稀釋成10 μg/μl的溶液，置于37℃溫箱孵育72 h，觀察其呈現(xiàn)明顯絮狀，孵育完成，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

大鼠用0.8%戊巴比妥鈉(0.1 ml/10 g，腹腔注射)麻醉后，固定于腦立體定位儀上。參照大腦腦立體定位圖譜，以前囟為原點，向后1.5 mm，旁開0.8 mm為穿刺點，顱鉆穿孔，自顱骨表面進針3.5 mm至側(cè)腦室，用微量注射泵將2 μl凝聚態(tài)Aβ25～35在5 min內(nèi)緩慢注入，留針5 min，使 Aβ25～35充分浸潤局部組織，退針后縫合傷口。對照組給予2 μl生理鹽水，其余兩組均為2 μl Aβ25～35。術(shù)后給予青霉素肌肉注射，傷口處碘伏消毒，1次/d，共5 d。

1.4水迷宮實驗 Morris水迷宮水池中加入適量的墨汁，使水池成為不透明色(去除視覺干擾)，平臺置于水面以下2 cm，水溫保持22～23℃。水迷宮實驗歷時6 d，1～5 d為定位航行實驗，將大鼠面向池壁放入水池，記錄大鼠從入水到找到水下隱蔽平臺并站立于其上所需時間，作為逃避潛伏期，大鼠找到平臺后，讓其在平臺上站立60 s。若入水后120 s大鼠未能找到平臺，則用木桿將其引導(dǎo)至平臺，并停留10 s，隨后用紙巾將大鼠擦干凈放回籠中，進行下一只大鼠實驗。第6天撤去平臺，進行空間探索實驗，將大鼠從同一個入水點放入水中，測其第1次到達原平臺位置的時間、120 s內(nèi)穿環(huán)次數(shù)。用于測量大鼠學(xué)會尋找平臺后，對平臺空間位置記憶的保持能力。

1.5免疫組織化學(xué)法檢測大鼠前額葉皮層CRMP-2和Caspase-3表達 每組各取一半大鼠用0.8%戊巴比妥鈉麻醉，經(jīng)4%多聚甲醛心臟灌流，用徠卡冰凍切片機對灌流固定好的組織進行冠狀面切片，厚度為30 μm。所得切片置于0.01 mol/L PBS (pH7.4)洗3次，每次5 min。用0.3% Triton X-100破膜處理2 h，2 h后用0.01 mol/L PBS 洗3次，然后用10%牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h。處理好的腦片分別用以下抗體(濃度)，兔多克隆抗體CRMP-2(1∶500)、兔多克隆抗體Caspase-3(1∶500)4℃ 孵育48 h。然后用0.01 mol/L PBS洗3次，用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1∶1 000)孵育2 h，0.01 mol/L PBS 洗3次，90%甘油封片，鏡檢、拍照，應(yīng)用Image Proplus6.0圖像分析軟件測平均積分光密度(IOD)。

1.6Western印跡法檢測大鼠前額葉皮層CRMP-2和p-CRMP-2表達 每組各取一半大鼠用0.8%戊巴比妥鈉麻醉，經(jīng)4%多聚甲醛心臟灌流，快速取出全腦，冰浴分離出大鼠前額葉皮層，按10 ml/g的比例加入全細胞裂解液，組織經(jīng)勻漿、超聲破碎后，用二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白定量，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，轉(zhuǎn)NC膜。雜交步驟如下：10%脫脂牛奶封閉NC膜1 h，TTBS(20 mmol/L Tris-HCl，pH7.5；0.15 mmol/L NaCl；0.05% Tween 20)漂洗3次，每次10 min，然后室溫下與兔多克隆抗體CRMP-2(1∶1 000)、兔多克隆抗體p-CRMP-2(Thr514)(1∶1 000)雜交反應(yīng)2 h，TTBS漂洗同前。再將NC膜與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1∶3 000)雜交反應(yīng)1 h。最后用TTBS漂洗NC膜3次，每次10 min，加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑反應(yīng)5 min，保鮮膜包裹，暗室進行X線膠片曝光、顯影和定影。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1Morris水迷宮實驗結(jié)果 與對照組相比，模型組逃避潛伏期和第1次到達原平臺位置的時間明顯延長，穿環(huán)次數(shù)明顯減少(P<0.01)；與模型組相比，美滿霉素組逃避潛伏期和第1次到達原平臺位置的時間明顯縮短，穿環(huán)次數(shù)明顯增加(P<0.01)。見表1。

表1 各組水迷宮、跳臺實驗結(jié)果比較

與對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；同表2

2.2免疫組織化學(xué)法檢測各組前額葉皮層CRMP-2和Caspase-3蛋白表達 與對照組比較，模型組CRMP-2蛋白表達顯著降低，Caspase-3表達顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，美滿霉素組CRMP-2蛋白表達顯著升高，Caspase-3表達顯著降低(P<0.01)。被標記上棕色或棕黃色的為陽性細胞。見圖1，表2。

圖1 各組大鼠前額葉皮層CRMP-2與Caspase-3的表達(×200)

組別CRMP-2(IOD)Caspase-3(IOD)CRMP-2p-CRMP-2對照組0.81±0.070.46±0.041.14±0.280.31±0.02模型組0.42±0.031)0.93±0.081)0.57±0.041)0.84±0.111)美滿霉素組0.65±0.052)0.78±0.062)0.73±0.092)0.56±0.052)

2.3Western印跡檢測各組前額葉皮層CRMP-2和p-CRMP-2表達 與對照組相比，模型組CRMP-2表達顯著降低，p-CRMP-2表達顯著上升(P<0.01)；與模型組相比，美滿霉素組前額葉皮層CRMP-2表達均顯著升高(P<0.01)，p-CRMP-2表達顯著下降(P<0.01)。見圖2，表2。

圖2 各組前額葉皮層CRMP-2和p-CRMP-2的表達

3 討 論

AD是由多種原因?qū)е碌哪X組織損傷，進而引起嚴重的認知功能障礙為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。據(jù)調(diào)查，2010年我國AD人數(shù)已躍居世界第一位，且隨著人口老齡化的加劇，AD 人數(shù)呈逐年增加的趨勢，給社會和患者家庭帶來嚴重的經(jīng)濟和精神負擔〔9〕。

前額葉皮層是大腦高級認知活動的關(guān)鍵區(qū)域，在注意力、情緒調(diào)節(jié)、學(xué)習(xí)記憶過程中起重要作用〔10〕。研究發(fā)現(xiàn)細胞凋亡在AD的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用〔11〕。Caspase-3是位于哺乳動物細胞凋亡通路下游關(guān)鍵的死亡蛋白酶。正常情況下，胞質(zhì)中的Caspase-3以無活性的酶原形存在，細胞凋亡信號的出現(xiàn)可導(dǎo)致 Caspase-3裂解、活化，活化的Caspase-3又進一步導(dǎo)致蛋白酶級聯(lián)切割放大，最終使細胞走向死亡〔2，12〕。因此Caspase-3表達量可以直接反映細胞凋亡程度。

CRMP-2是CRMP家族中的一員，在神經(jīng)組織內(nèi)廣泛表達，參與神經(jīng)元突起的生長、鈣離子內(nèi)態(tài)穩(wěn)定性等多種神經(jīng)生理活動，對神經(jīng)的生長發(fā)育具有重要作用〔3〕。研究報道，CRMP-2可抑制凋亡前體基因p53的表達，調(diào)節(jié)Sema3A誘導(dǎo)的細胞凋亡〔13〕。幸享鳳等〔14〕證實CRMP-2可通過上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Caspase-3及p53的表達改善神經(jīng)細胞凋亡，減輕缺血再灌注造成的大鼠神經(jīng)功能缺損。增加CRMP-2的磷酸化水平可以導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡〔4〕。

本文結(jié)果表明美滿霉素對細胞凋亡的抑制和CRMP-2通路有關(guān)，可以通過上調(diào)CRMP-2表達、降低CRMP-2磷酸化水平，進而下調(diào)Caspase-3的表達，抑制神經(jīng)細胞凋亡，改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。