TNF-α介導(dǎo)的NF-κB通路在沙塵導(dǎo)致大鼠慢性咽炎中的作用及射干對(duì)其影響

劉雨娟 王 莉 姚 蘭 藺興遙

(河西學(xué)院醫(yī)學(xué)院，甘肅 張掖 734000)

研究發(fā)現(xiàn)〔1〕，在揚(yáng)沙發(fā)生當(dāng)天人群以呼吸系統(tǒng)為主的自覺(jué)癥狀發(fā)生率明顯升高，揚(yáng)沙過(guò)后開(kāi)始下降，這些癥狀包括咳嗽、胸悶氣短、咽干咽痛、眼睛干澀等。甘肅河西地區(qū)是中國(guó)西北干旱區(qū)沙塵暴活動(dòng)比較頻繁的地區(qū)，楊振華等〔2〕研究顯示河西地區(qū)(民勤)居民呼吸系統(tǒng)受沙塵影響最大，其中沙塵誘發(fā)的5種最常見(jiàn)疾病中咽喉炎的發(fā)生率占到了18.8%?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載：射干味苦寒，具有清熱解毒、利咽消痰等功效，為治療喉痹咽痛之藥物，主治咽喉疾患之方劑大多以射干為君藥組方，其效頗佳。我們前期的臨床研究也證實(shí)，以射干為君藥的中藥復(fù)方對(duì)河西地區(qū)沙塵引發(fā)咽炎的治療有較好的療效。目前有關(guān)河西地區(qū)沙塵引發(fā)慢性咽炎及射干治療此類疾患的作用機(jī)制報(bào)道甚少，因此本實(shí)驗(yàn)擬初步探討射干治療沙塵顆粒物所致的慢性咽炎的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 健康成年SD大鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，共60只，體重(200±20)g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心提供。藥物、主要試劑及儀器：射干水煎液，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心中藥前處理室提供。依那西普由輝瑞制藥有限公司提供；腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1、IL-6、丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-AOC)、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB試劑盒由西安科昊生物工程有限責(zé)任公司提供。沙塵模擬實(shí)驗(yàn)平臺(tái)由甘肅省人民醫(yī)院、中科院寒旱所聯(lián)合研制。酶聯(lián)免疫分析儀(BIO-TEC，U.S.A)；紫外分光光度計(jì)(UV-2401PC，日本)。

1.2方法 大鼠隨機(jī)分組后，空白對(duì)照組每天于沙塵模擬實(shí)驗(yàn)平臺(tái)給予正常吹風(fēng)，不吸入沙塵，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后的第31天開(kāi)始，每天以生理鹽水灌胃1 ml/100 g；模型組每天于沙塵模擬實(shí)驗(yàn)平臺(tái)造模2 h，風(fēng)速8 m/s，共45 d；依那西普組和射干組同模型組，但依那西普組在造模開(kāi)始后的第31、38、45天按劑量皮下注射依那西普3次；射干組于造模開(kāi)始后的第31天開(kāi)始，每天灌胃相應(yīng)劑量的藥物共15 d。最后一天給藥后2 h，各組大鼠以戊巴比妥鈉麻醉，股動(dòng)脈采血，分離血清，測(cè)定TNF-α、IL-1、IL-6、NF-κB含量，檢測(cè)方法均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。采血后剪取咽部組織約0.8～1.0 g 2份，一份采用分光光度法檢測(cè)MDA、T-AOC含量；一份用于病理組織切片，組織取材后，迅速投入10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色。

1.3藥物濃度的計(jì)算 沙塵顆粒物(直徑≤10 μm，PM10)，濃度水平>167.5 μg/m3。射干水煎液，成人每日服用量按藥典為0.13 g生藥/kg，大鼠灌胃劑量按成人6倍計(jì)算為0.78 g/kg，臨用前以蒸餾水配制成濃度為7.8%的溶液，冰箱保存?zhèn)溆?。依那西普凍干粉劑，臨床成人治療劑量為0.36 mg/kg，每周1次，大鼠腹部皮下注射劑量按成人6倍計(jì)算為2.16 mg/kg。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1咽部組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變 空白對(duì)照組咽部組織結(jié)構(gòu)清晰，黏膜上皮光滑，固有層可見(jiàn)散在淋巴組織和腺泡，黏膜下有少量小血管，肌層纖維排列規(guī)則；模型組咽部組織分界不清，固有層和黏膜下水腫，小血管增多、充血，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，少量深入肌層組織，肌纖維排列不規(guī)則；依那西普組和射干組黏膜上皮逐漸恢復(fù)平整，黏膜上殘留少量黏液，黏膜和黏膜下可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

2.2沙塵對(duì)大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB及咽部組織T-AOC、MDA等的影響 與空白對(duì)照組相比，模型組中IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB及MDA含量均明顯升高，T-AOC含量則明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1，表2。

2.3藥物對(duì)大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB及咽部組織T-AOC、MDA等的影響 與模型組相比，依那西普組和射干組IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB及MDA含量均明顯降低，T-AOC含量明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而依那西普組與射干組相比，以上指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1，表2。

表1 各組血清IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB水平比較

與空白對(duì)照組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較:3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

表2 各組咽部組織MDA、T-AOC含量比較

圖1 各組咽部組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變(HE染色，×400)

3 討 論

慢性咽炎為咽部黏膜、黏膜下及淋巴組織的慢性炎癥，表現(xiàn)為黏膜慢性充血，血管周圍淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜及黏膜下結(jié)締組織增生，腺體肥大，黏液分泌增多。炎癥反應(yīng)是由多細(xì)胞、多因子參與的非常復(fù)雜的反應(yīng)，其中炎性細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)增多。TNF-α、IL-1、IL-6是由炎性細(xì)胞合成和釋放的主要的促炎細(xì)胞因子，研究〔3〕表明TNF-α、IL-1、IL-6過(guò)量表達(dá)參與慢性炎癥性疾病。除此之外，TNF-α、IL-1、IL-6作為細(xì)胞外刺激因子，又可激活NF-κB，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)〔3〕。沙塵中的PM2.5 具有產(chǎn)生活性氧自由基(ROS)的能力〔4〕，ROS能引發(fā)細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的終末產(chǎn)物，過(guò)多的脂質(zhì)過(guò)氧化物可導(dǎo)致機(jī)體的T-AOC減弱。氧自由基是炎癥反應(yīng)的效應(yīng)器，氧自由基的過(guò)度產(chǎn)生也能通過(guò)模式識(shí)別受體分子(PRRs)和非模式識(shí)別受體誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)〔5〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，河西地區(qū)沙塵顆粒物引發(fā)慢性咽炎時(shí)，增高促炎因子的水平，上調(diào)NF-κB的表達(dá)，降低機(jī)體的抗氧化能力，與上述結(jié)論一致。射干提取物對(duì)炎癥有明顯的抑制作用，且有一定的解熱作用〔6〕。吳澤芳等〔7〕的研究還顯示，射干能明顯抑制巴豆油所致的炎性滲出和增生，對(duì)醋酸所致腹腔毛細(xì)血管通透性的增高有明顯的抑制作用。除此之外射干還具有較強(qiáng)的清除自由基的作用〔8〕，也能增強(qiáng)抗氧化酶〔超氧化物歧化酶(SOD)，過(guò)氧化氫酶等〕的活性，從而減輕對(duì)機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示射干可明顯降低河西地區(qū)沙塵顆粒物引發(fā)慢性咽炎時(shí)促炎因子的水平，也能增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，因此推測(cè)射干可能通過(guò)降低促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6及ROS的表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，以抑制沙塵顆粒物所致的咽部組織的慢性炎癥損傷反應(yīng)。

TNF-α屬于TNF家族，為多功能的細(xì)胞因子，可以激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)蛋白酶、Jun氨基末端激酶(JNK)和NF-κB三條信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)其細(xì)胞毒性、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能。TNF受體存在兩種類型：TNF-R1和TNF-R2，均屬于Ⅰ型膜蛋白。TNF-R2的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路目前并不太清楚。TNF-α與TNF-R1結(jié)合后，通過(guò)一系列接頭分子和信號(hào)分子的傳導(dǎo)，最后激活NF-κB，活化的NF-κB進(jìn)入核內(nèi)誘導(dǎo)促炎因子(TNF-α、IL-1、IL-6)、趨化因子(IL-8)等炎性基因及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β基因的表達(dá)參與免疫與炎癥反應(yīng)，NF-κB是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的重要因子〔9〕。依那西普是TNF-α拮抗劑，通過(guò)抑制TNF-α與TNF-R1結(jié)合起到控制炎癥的作用。本實(shí)驗(yàn)選用依那西普后，明顯抑制沙塵顆粒物引發(fā)的慢性咽炎中NF-κB的表達(dá)水平，并降低TNF-α、IL-1、IL-6的表達(dá)，從而減輕咽部炎癥的損傷，提示NF-κB的激活可能是沙塵誘導(dǎo)咽部炎癥損傷的重要因素之一。在沙塵組中，隨著NF-κB通路中的兩個(gè)上游分子TNF-α、IL-1表達(dá)顯著上調(diào)，NF-κB的表達(dá)也明顯上調(diào)；而射干組中當(dāng)TNF-α、IL-1、IL-6的表達(dá)明顯下調(diào)，NF-κB的表達(dá)也明顯下調(diào)。這些結(jié)果說(shuō)明在沙塵誘導(dǎo)的慢性咽炎中，沙塵顆粒物可以激活NF-κB信號(hào)通路中的上游分子TNF-α、IL-1，并使信息繼續(xù)傳遞到下游激活NF-κB，使炎癥介質(zhì)的表達(dá)增加，而射干可能通過(guò)抑制TNF-α、IL-1介導(dǎo)的NF-κB激活來(lái)抑制沙塵顆粒物對(duì)咽部組織的炎癥損傷反應(yīng)。