超氧化物歧化酶對復發性阿弗他潰瘍家兔T細胞亞群水平變化的影響

甘成文 鄧 偉 廖天安 張 熹 馮冬嬋 王 濤

(海南省人民醫院口腔頜面外科，海南 海口 570311)

復發性阿弗他潰瘍(RAU)見于口腔黏膜幾乎所有部位，發病率高且易反復發作，病程周期長常伴有明顯灼痛感〔1〕。引起RAU的因素包括：基因決定的遺傳因素、環境因素、免疫力低下、感染、潰瘍等消化系統疾病等，但其具體致病機制尚不明確，但是氧自由基的增多被廣泛認為是導致RAU頻繁發作的主要原因之一〔2，3〕。超氧化物歧化酶(SOD)是一種生物活性物質是重要的抗氧化酶之一，也是生物體內清除自由基的首要物質，可有效清除體內自由基等保護機體免受傷害。本研究通過動物實驗探討SOD對家兔T細胞亞群水平的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物與主要試劑、儀器 雄性普通級家兔30只，體重1.5～2.0 kg，單籠飼養，自由飲水，室溫(20±2)℃，相對平均濕度45%，實驗室適應性喂養1 w，采用隨機數字表法分為空白對照組、陽性對照組和SOD組各10只。流式細胞儀：CytoFLEX型，貝克曼公司；病理切片機：CUT4062型，德國SLEE公司；勻漿機：T10型，德國IKA公司；乙醚：德音化工；甲基紫精：上海如吉生物科技發展有限公司；SOD生物膠囊：EP1317，福建華燦生物科技有限公司；白細胞介素(ILs)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒：上海恒遠生物科技有限公司；血細胞裂解液：上海嶸崴達實業有限公司。

1.2RAU模型建立 在室溫20～22℃取家兔兔板固定，乙醚麻醉，止血鉗分開其上下頜，鋼平尺鑷輕輕抻拉出家兔的右側頰囊部，然后選用5號皮試注射器，準確地均勻扇形注射約0.25 ml甲基紫精溶液，于右側頰囊部位黏膜下層大約0.8 cm處緩慢推入。24 h后在注射部位黏膜可見潰瘍形成。待家兔在口腔黏膜反復多次出現規則圓形或橢圓形的邊緣整齊且表面覆有灰黃色假膜的潰瘍，鏡下組織病理表現為潰瘍表面覆蓋有大量壞死組織和炎性的滲出物，潰瘍基底部毛細血管擴張，同時伴有中性、淋巴及單核細胞浸潤，可確定為模型建立完成〔4,5〕，納入陽性對照組和SOD組。

1.3給藥方法 SOD組每天進行SOD生物膠囊溶液灌胃，陽性對照組和空白對照組給予蒸餾水灌胃，藥物劑量1 g/次，頻率3次/d，連續2 w〔4〕。

1.4組織病理學觀察 模型建立完成2 d后，取陽性對照組和SOD組口腔潰瘍病變組織；灌胃 7 d后，取陽性對照組和SOD組口腔潰瘍病變組織，經過HE染色后鏡下進行組織學檢查。空白對照組取相應位置口腔黏膜組織進行組織學檢查。

1.5流式細胞儀檢測 將CD4+/CD8+免洗試劑加入到絕對計數管中，再加抗凝血試劑室溫避光孵育15 min，再加血細胞裂解液室溫孵育15 min，進行流式細胞儀軟件分析檢測。

1.6ELISA檢測 各組血清中腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6和IL-8檢測，在分別取實驗進行前，模型建立完成時及灌胃結束時，SOD組、陽性對照組及空白對照組耳緣靜脈血4 ml，以口腔黏膜組織勻漿液作為抗原，來檢測血清中抗口腔黏膜組織勻漿液的抗體〔6，7〕。按ELISA試劑盒使用說明嚴格操作。

1.7統計學方法 應用SPSS19.0統計軟件進行方差分析，LSD檢驗。

2 結 果

2.1組織病理學觀察 空白對照組黏膜上皮連續完整，固有層結締組織致密，黏膜下層較厚可見小涎腺體；陽性對照組黏膜表面有斷裂，覆蓋假膜，并且有密集淋巴細胞、固有層有大量單核細胞及炎癥細胞，毛細血管存在充血性擴張，血管內皮細胞呈腫脹狀，且可見壞死區域；SOD組各個潰瘍面表現為愈合狀態，上皮可見完整且增厚組織，黏膜下有松散的結締組織存在，并且有新鮮毛細血管。見圖1。

圖1 各組口腔黏膜組織HE染色(×400)

2.2各組外周血T淋巴細胞亞群比較 空白對照組CD4+T淋巴細胞及CD4+/CD8+比值均明顯高于陽性對照組和SOD組，而CD8+T淋巴細胞明顯少于陽性對照組和SOD組(P<0.05)；SOD組CD4+T淋巴細胞和CD4+/CD8+比值較陽性對照組顯著升高，而CD8+T淋巴細胞較陽性對照組顯著下降(P<0.05)。見表1。

2.3各組血清TNF-α、IL-1及IL-2比較 空白對照組TNF-α、IL-6和IL-8均明顯低于陽性對照組和SOD組(P<0.05)；SOD組TNF-α、IL-6和IL-8較陽性對照組顯著降低(P<0.05)。見表2。

表1 各組外周血T淋巴細胞亞群比較

與空白對照組比較：1)P<0.05；與陽性對照組比較：2)P<0.05；表2同

表2 各組外周血TNF-α、IL-6和IL-8比較

3 討 論

RAU發生是多種因素共同作用的結果，患者免疫功能降低或亢進等免疫功能異常，基因決定的遺傳基礎，胃潰瘍、十二指腸潰瘍等消化系統疾病，其他疾病合并的感染及心理壓力、工作生活環境等環境因素都會引起發作，研究證實〔6～8〕，除上述因素外還有其他原因可導致RAU發生，生物體體內氧自由基的增多可導致其頻繁發作〔9〕。自由基是帶電荷的原子或原子團〔10〕，動物體內以氧自由基存在為主包括：超氧陰離子自由基(O2-)、羥基自由基(-OH)和過氧化氫(H2O2)，氧自由基活性極強容易參與反應搶奪電子，紫外輻射、添加劑、環境污染等外部因素及新陳代謝均會產生氧自由基〔11〕。正常生理狀態下，氧自由基的清除與產生保持動態平衡，病變時氧自由基不能被及時清除，可與周圍組織的大分子搶奪電子，破壞細胞膜、內質網、溶酶體、DNA和RNA〔12〕，膠原蛋白變性使病變部位交聯，致使組織發生病理改變，引起細胞損傷、衰老、非正常死亡甚至癌變〔13,14〕。SOD是生物體內一種生物活性物質也是重要的抗氧化酶，可清除生物體新陳代謝過程中產生的有害物質，最為重要的是它可清除氧自由基，起到保護機體的作用〔15〕。