siRNA靶向沉默TrkB基因對人膀胱癌細胞株T24生長和轉移的影響及其分子機制

邢增術 張 沖 劉振湘 白志明

(中南大學湘雅醫學院附屬?？卺t院泌尿外科，海南 海口 570208)

近年來研究發現〔1～3〕，酪氨酸激酶受體(Trk)B在某些惡性腫瘤組織中過度表達，導致腫瘤細胞的增殖能力和侵襲轉移能力明顯提高，但其在膀胱癌增殖轉移分子機制中的具體作用國內外未見報道。本研究探討siRNA靶向沉默TrkB基因對膀胱癌細胞株T24生長和轉移的影響及其分子機制。

1 材料和方法

1.1材料 (1)細胞株：人膀胱癌T24細胞購自中國典型培養物保藏中心(CCTCC)。(2)主要耗材及試劑：超低黏附培養板購自美國Corning 公司；人重組腦源性神經營養因子(rhBDNF)購自美國R&D公司；Lipofectamin2000購自美國Invitrogen公司；委托廣州銳博生物科技有限公司設計和合成siRNAOligo；一抗和二抗均購自美國Santa Cruz 公司。

1.2細胞培養 將膀胱癌T24細胞培養于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養液，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，待細胞近90%融合時用胰蛋白酶消化傳代。

1.3T24細胞的siRNA轉染 TrkB(NTRK2)-siRNA1：上游5′-CCGUCACCUUGACUUGUCUTT-3′，下游5′-AGACAAGUCAAGGUGACGGTT-3′；TrkB(NTRK2)-siRNA2：上游5′-CCACGAACAGAAGUAAUGATT-3′，下游5′-UCAUUACUUCUGUUCGUGGTT-3′；TrkB(NTRK-2)-siRNA3：上游5′-GCGCUUCAGUGGUUCUAUATT-3′，下游5′-UAUAGAACCACUGAAGCGCTT-3′；陰性對照組：上游5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。按Lipofectami-n2000進行轉染，轉染后48 h檢測目的基因蛋白，選擇敲低效率最高者留作進一步實驗。

1.4吖啶橙(AO)/溴乙啶(EB)雙染色法觀察細胞失巢凋亡情況 將轉染TrkB-siRNA的T24細胞和陰性對照細胞(轉染NT-siRNA)分別置于6孔超低黏附性培養板中與濃度為100 ng/ml 100 μl的rhBDNF共懸浮培養72 h，分別收集兩組細胞制成細胞懸液。按試劑盒說明操作后熒光顯微鏡下觀察。

1.5MTT法檢測細胞生長 于細胞對數生長期，收集轉染TrkB-siRNA的T24細胞和陰性對照細胞(轉染NT-siRNA)，分別制成細胞懸液后接種于96孔板，每孔加入濃度為100 ng/ml 100 μl的rhBDNF共培養。于培養第0、12、24、48、72、96 h時各時間點分別收獲細胞，按MTT法在酶標儀上檢測各孔的OD值，繪制生長曲線。

1.6軟瓊脂克隆形成試驗檢測細胞克隆形成能力 分別取對數期轉染siRNA-TrkB的T24細胞和陰性對照細胞(轉染NT-siRNA)，與濃度為100 ng/ml 100 μl的rhBDNF共培養在制備好的軟瓊脂6孔板中10 d，計數含50個細胞以上的克隆數，計算細胞集落形成率。

1.7Transwell小室法檢測細胞侵襲能力 收集轉染TrkB-siRNA的T24細胞和陰性對照細胞(轉染NT-siRNA)，加入無血清培養基制成細胞懸液，接種于鋪有Matrigel基質膠的Transwell小室上室，并加入rhBDNF；下室加入含20% FBS的RPMI1640培養基，培養24 h，棉簽擦去上室未穿膜細胞，甲醇固定再予結晶紫染色，鏡下隨機5個視野(×100)拍照并計數穿過膜的細胞數。

1.8Western印跡檢測蛋白表達 用RIPA裂解液裂解細胞蛋白，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，經十二烷硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，低溫恒壓電轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，加入山羊抗兔辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫下孵育1 h，電化學發光法(ECL)化學發光，與內參β-actin比較，Image J軟件進行定量分析。

1.9統計學處理 用SPSS19.0軟件進行t檢驗或單因素方差分析。

2 結 果

2.1靶向沉默TrkB基因siRNA序列的篩選 TrkB-siRNA轉染T24細胞以敲低TrkB的表達，并通過Western印跡檢測敲低效率，選擇敲低效率最高的TrkB-siRNA3(圖1)進行下一步實驗。

圖1 膀胱癌細胞株T24轉染NT-siRNA或siRNA-TrkB 48 h后Western印跡

2.2siRNA靶向沉默TrkB基因對膀胱癌細胞株T24抗失巢凋亡能力的影響 沉默TrkB基因的T24細胞經懸浮培養后大量凋亡，多個視野可見晚期凋亡細胞，核染色質發橙紅色熒光，呈固縮或串珠狀，有時核碎裂散布于胞質中，只有極少量正常活細胞可見。而陰性處理組T24細胞經懸浮培養后亦有細胞凋亡情況，但多個視野下可見許多正?；罴毎?，核染色質著綠色并呈正常結構(圖2)。表明siRNA靶向沉默TrkB基因后膀胱癌T24細胞的抗失巢凋亡能力明顯下降。

圖2 NT-SiRNA T24懸浮培養72 h AO/EB雙染色熒光顯微鏡觀察(×400)

2.3siRNA靶向沉默TrkB基因對膀胱癌細胞株T24增殖、克隆形成、遷移及侵襲能力的影響 與陰性處理組相比，靶向沉默TrkB基因后T24細胞的增殖、克隆形成、遷移及侵襲能力明顯降低，差異均有統計學意義(均P<0.05)，見圖3～6，表1。

與NT-siRNA組比較：1)P<0.05；同表1，表2圖3 沉默TrkB對膀胱癌T24細胞增殖能力的影響

組別細胞增殖率(×100%,n=10)克隆形成率(%,n=6)遷移力(劃痕愈合比,n=6)侵襲力(細胞個數/HP,n=6)NT-siRNA組5.54±0.3546.70±4.550.36±0.02101.00±11.20TrkB-siRNA組3.21±0.311)24.50±3.041)0.22±0.031)32.38±3.291)

圖4 沉默TrkB對膀胱癌T24細胞克隆形成能力的影響(×200)

圖5 沉默TrkB對膀胱癌T24細胞遷移能力的影響(×200)

圖6 沉默TrkB對膀胱癌T24細胞侵襲能力的影響(×200)

2.4siRNA靶向沉默TrkB基因對膀胱癌細胞株T24磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信號轉導通路活性及上皮間質轉化(EMT)相關蛋白的影響 與NT-siRNA組相比，靶向沉默TrkB基因后，T24細胞E-鈣黏蛋白(cadherin)的表達水平明顯提高，而N-cadherin、波形蛋白(Vimentin)表達水平明顯下降，p-Akt及EMT 相關核蛋白扭曲蛋白(Twist)、Snail、Slug表達水平顯著下降，差異均有統計學意義(均P<0.05)，見表2，圖7。

表2 siRNA靶向沉默TrkB基因對膀胱癌細胞株T24 PI3K-Akt信號轉導通路活性及EMT相關蛋白的影響

圖7 沉默TrkB對T24細胞PI3K-Akt信號轉導通路及EMT相關蛋白的影響

3 討 論

膀胱癌是泌尿生殖系統最常見的腫瘤之一，因其具有起源多中心性，易復發、轉移等生物學特性，經治療后仍有30%的患者后期發生腫瘤侵襲和轉移，成為威脅患者生命的最重要因素〔4〕。

TrkB與其配體BDNF結合可激活多個重要信號傳導通路，包括PI3K-Akt途徑、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑和磷脂酶C途徑，這些信號通路與細胞凋亡、增殖和浸潤轉移關系密切〔5，6〕。特別是近來研究發現TrkB在多種腫瘤中高表達，提示TrkB可能作為一種原癌基因在腫瘤的發生和轉移過程中發揮重要作用〔1～3〕。本研究結果提示TrkB基因可明顯影響膀胱癌T24細胞的增殖及轉移侵襲能力。為進一步了解TrkB影響膀胱癌T24細胞轉移侵襲能力的可能分子機制，本研究發現靶向沉默膀胱癌T24細胞的TrkB基因后，不僅其PI3K-Akt信號轉導通路的活性下降，而且EMT受抑制，使得細胞的增殖及轉移侵襲能力明顯下降。據研究〔7，8〕，BDNF特異性與TrkB的胞外區結合后可誘導胞內酪氨酸殘基磷酸化，啟動BDNF-TrkB信號轉導通路，其下游的PI3K-Akt信號轉導通路隨之被激活，被磷酸化激活的Akt在下調促凋亡蛋白Bad、Bim表達的同時，上調抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達，導致失巢凋亡抵抗的發生，賦予腫瘤細胞遷移到其他部位再次生長的能力。因此TrkB可激活PI3K-Akt信號通路使腫瘤細胞獲得失巢凋亡抵抗特性，從而發生轉移。EMT是大多數上皮性腫瘤發生侵襲轉移的一個極其重要的初始步驟〔9〕。研究表明〔10〕，TrkB可經PI3K/Akt信號轉導通路激活下游EMT相關核蛋白，如Twist、Snail、Slug和ZEB1，后者與核內E-cadherin 轉錄啟動子結合，從而下調其轉錄表達，導致腫瘤細胞間黏附能力下降；而間充質標志物如N-cadherin、Vimentin表達上調，促使cadherin轉換現象的發生，使得腫瘤細胞的遷移能力明顯提高。這可能是上皮腫瘤發生侵襲和轉移的細胞分子生物學基礎。

綜上，siRNA靶向沉默TrkB基因可通過下調膀胱癌T24細胞PI3K-Akt信號轉導通路的活性進而抑制EMT，從而降低其增殖及轉移侵襲能力。本研究為膀胱癌的治療策略提供了新的依據。