鐵皮石斛和金釵石斛雜交后代的分子鑒定

劉玉洋，徐靖，何金宇，劉朋麗，史鈺軍，王慧中*，盧江杰*

(1.杭州師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036； 2.浙江省藥用植物種質(zhì)改良與質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室，浙江 杭州 310036； 3.浙江省珍稀植物藥工程技術(shù)研究中心，浙江 武義 321200； 4.浙江工商大學(xué) 外國語學(xué)院，浙江 杭州 310018)

鐵皮石斛和金釵石斛是2種被《中華人民共和國藥典(2015版)》收錄的蘭科石斛屬(Dendrobium)植物，兼具觀賞和藥用價值[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，石斛對咽喉疾病、腸胃疾病、白內(nèi)障、心血管疾病、糖尿病、腫瘤均具有顯著療效，特別是對人體肺癌細(xì)胞具有高達(dá)74.7%～97.2%的抑制率[2-3]。鐵皮石斛是珍稀瀕危藥用植物保護(hù)利用的典范，經(jīng)過二十多年的市場培育，已形成了集科研、種植、加工、銷售為一體的鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)。2016年浙江省鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)產(chǎn)值達(dá)45億元，是全國產(chǎn)銷量最大的保健食品之一。金釵石斛是傳統(tǒng)中成藥石斛夜光丸、石斛明目丸、石斛清胃散以及現(xiàn)代中成藥脈絡(luò)寧注射液、復(fù)方“清咽寧”等的重要配伍成分，同樣具有巨大的市場需求和經(jīng)濟(jì)價值[4]。由于市場需求巨大，一方面過度采挖導(dǎo)致野生石斛資源遭到破壞，而且石斛品種繁多，品質(zhì)參差不齊；另一方面，集約化的栽培需要優(yōu)良的新品種。這就急需廣大科研工作者開展石斛新品種選育的相關(guān)研究。

雜交后形成的分離群體是親本遺傳圖譜構(gòu)建、優(yōu)良性狀定位和相應(yīng)性狀標(biāo)記輔助育種的重要材料。雜交后代鑒定的方法主要有形態(tài)觀察鑒定[5]、細(xì)胞學(xué)鑒定[6]、同工酶鑒定[7]、分子標(biāo)記鑒定[8]等，與傳統(tǒng)的鑒定方法相比，分子標(biāo)記技術(shù)對雜交后代進(jìn)行鑒定能夠快速準(zhǔn)確地鑒定出真雜交種，提高了育種效率。SSR分子標(biāo)記具有共顯性、等位基因數(shù)量多、多態(tài)性高、重復(fù)性好、分析簡單等優(yōu)點[9]。謝文剛等[10]利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對140個鴨茅雜交單株進(jìn)行鑒定，利用3對特異引物可快速鑒定出雜交種111份。張自強(qiáng)等[11]對2個馬鈴薯雜交組合F1群體進(jìn)行SSR鑒定，表明SSR分子標(biāo)記技術(shù)用于馬鈴薯雜交種鑒定是可靠的。張冰清等[12]利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對雜交油菜品種進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)SSR技術(shù)鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)田間鑒定方法結(jié)果一致，證明SSR標(biāo)記可用于雜交油菜的鑒定。

作為中藥材，石斛種間雜交產(chǎn)生的后代在不清楚其藥用價值時，是不允許被用于生產(chǎn)的。但是在遺傳學(xué)研究中，種間雜交由于性狀差異明顯，往往比種內(nèi)雜交可以獲得性狀分離更加明顯的后代，從而有利于開展遺傳圖譜構(gòu)建和優(yōu)良性狀定位。目前，對石斛的研究大多集中在有效成分、遺傳多樣性等方面，其雜交群體的創(chuàng)制、遺傳圖譜的構(gòu)建、以及重要性狀的QTL定位研究較少。本研究利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對鐵皮石斛和金釵石斛的雜交F2代群體進(jìn)行雜種鑒定，通過構(gòu)建有效的種間雜交分離群體，進(jìn)而開展鐵皮石斛和金釵石斛的遺傳圖譜構(gòu)建，石斛多糖和石斛堿等活性成分的QTL定位。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用的雜交父本鐵皮石斛(♂)為金華壽仙谷藥業(yè)有限公司育成的仙斛1號(認(rèn)定編號：浙認(rèn)藥2008003)，雜交母本金釵石斛(♀)為浙江省藥用植物種質(zhì)改良與質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室從云南收集的野生種質(zhì)。從2010年開始進(jìn)行雜交，2011年獲得雜交F1代，2014年雜交F1代自交，2015年獲得F2代分離群體。從F2代中隨機(jī)挑選131個單株作為本試驗的研究對象。摘取適量嫩葉片，放入-70 ℃冰箱中保存，以用于提取基因組DNA。

1.2 方法

1.2.1 雜交后代基因組DNA提取

用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程公司)提取石斛基因組DNA，用1%的瓊脂糖凝膠檢驗純度，用紫外分光光度計(NanoDrop2000)檢測濃度，并將各DNA樣品稀釋至20 ng·μL-1，4 ℃冰箱保存，用于后續(xù)實驗。

1.2.2 SSR引物篩選

浙江省藥用植物種質(zhì)改良與質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室開發(fā)的320對石斛屬SSR引物[13]，由上海生工生物公司合成。以金釵石斛和鐵皮石斛基因組DNA作為模板，對引物進(jìn)行初步篩選，條帶清晰、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富的SSR引物用于后續(xù)實驗。

1.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系：總體積10 μL，10×Buffer(含Mg2+)1 μL，dNTPs(10 mmol·L-1)0.3 μL，正向引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，反向引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，Taq酶(2 U·L-1)0.5 μL，DNA模板(20 ng·μL-1)1 μL，ddH2O 6.2 μL(PCR試劑均來自北京鼎國公司)。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)程序如下：在Thermal Cycler T100 PCR儀中，94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，各引物退火溫度下復(fù)性40 s，72 ℃延伸90 s，共32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。

1.2.4 PAGE膠電泳檢測

將矩形玻璃板和凹形玻璃板洗凈并擦干后，用夾子分別夾住玻璃板兩端，水平放置。在燒杯中加入8%丙烯酰胺40 mL，10%過硫酸銨280 μL，TEMED 26 μL，搖勻后水平灌膠，排除氣泡，立即插上68孔梳子，放置30 min。將玻璃板放到電泳槽(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)中，向電泳槽中加入適量1×TBE緩沖液，拔出梳子，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL 6×上樣緩沖液混合均勻，上樣。恒定電壓180 V電泳分離1.5 h。電泳結(jié)束后，將聚丙烯酰胺凝膠用蒸餾水漂洗2次。加入800 mL 0.1%的AgNO3溶液染色20 min，用蒸餾水漂洗2次。加入800 mL顯影液(12 g氫氧化鈉溶液，0.152 g四硼酸鈉)和1 mL甲醛，當(dāng)凝膠上出現(xiàn)清晰的條帶后用蒸餾水漂洗10 s。取出凝膠至顯影燈上，拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 石斛基因組DNA檢測

用1%的瓊脂糖凝膠檢測石斛基因組DNA純度，取5 μL提取的石斛基因組DNA溶液和1 μL 6×上樣緩沖液混合均勻后點樣，標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量選用15 K Marker(北京全式金公司)，D260/D280在1.8～2.0，無蛋白質(zhì)、RNA污染，電泳結(jié)果如圖1。

2.2 石斛SSR引物篩選結(jié)果

從320對SSR引物中初步篩選出57對條帶清晰、有差異的引物用于后續(xù)石斛雜交群體的鑒定(圖2)。

2.3 SSR引物帶型分析

從57對SSR引物中篩選出3對特異性SSR引物可用于石斛雜交群體F2代真雜交種的鑒定。3對SSR引物詳細(xì)信息見表1。

29～1 147分別表示圖中所示27對引物來源于篩選所得57對可用于雜交后代多態(tài)性鑒定的引物圖2 部分引物的篩選電泳

名稱SSR上游引物(5'-3')下游引物(5'-3')大小/bpDNtSSR013(AAACA)4GCCAAATTTCCTCCCAAAATGCAAGATGGGCTATGGTGAT255DNtSSR147(CTCCGA)4ACGAAGACGGTTCACTCCACCACGAGAGACTTCCAGAGGC176DNtSSR150(CCG)7AATGATGGCGGTCGATACTCTGCAGTGTCAAAGGTACCCA220

通過電泳圖分析(圖3)，我們將雜交群體單株的帶型分為真雜交種型、父本型、母本型、缺失型[11]。同時具有父本和母本一條或一條以上特征帶型的為真雜交種；與母本帶型相同的為母本型；與父本帶型相同的為父本型；與父本或母本帶型相似但缺失部分條帶的為缺失型。若雜交群體F2代中單株帶型為真雜交種型，可認(rèn)定為真雜交種；若雜交種的帶型為缺失型、父本型或母本型，則需要用其他引物進(jìn)一步判斷。

2.4 石斛雜交群體F2代真雜交種的鑒定

A，真雜交種型；B，母本型；C，父本型；D，缺失型圖3 SSR引物圖譜的帶型

引物DNtSSR013、DNtSSR147、DNtSSR150對石斛雜交群體F2代擴(kuò)增的聚丙烯酰胺凝膠電泳如圖4～6。

M表示；1～131分別表示從F2代中隨機(jī)挑選的131個單株。圖5～6同圖4 DNtSSR013對金釵石斛(♀)×鐵皮石斛(♂)雜交種F2代(1-131)的擴(kuò)增電泳

圖5 DNtSSR147對金釵石斛(♀)×鐵皮石斛(♂)雜交種F2代的擴(kuò)增電泳

圖6 DNtSSR150對金釵石斛(♀)×鐵皮石斛(♂)雜交種F2代的擴(kuò)增電泳

利用篩選出的3對引物對鐵皮石斛、金釵石斛2個親本及131個雜交群體F2代進(jìn)行鑒定。首先用引物DNtSSR013進(jìn)行鑒定，在250～280 bp處共有3條帶，母本有2條特征帶，父本有1條特征帶，在雜交群體F2代中同時具有父本、母本特征帶的有85個單株，鑒定為真雜交種。剩余的46個單株中有19個單株為父本型，27個單株為缺失型，因為用一對引物鑒定石斛雜交群體有其局限性，這些無法鑒定為真雜交種的單株需要用其他引物進(jìn)一步進(jìn)行鑒定(圖4)。其次用引物DNtSSR147對雜交群體F2代進(jìn)行鑒定，在160～180 bp處共有3條帶，母本有1條特征帶，父本有2條帶，在剩余的46個單株中同時具有父本、母本特征帶的有8個單株，鑒定為真雜交種(圖5)。最后利用引物DNtSSR150進(jìn)一步鑒定，在200～250 bp處共有3條帶，母本有1條特征帶，父本有2條特征帶，從剩余的38個單株中鑒定出26個單株同時具有母本、父本的一條特征帶，鑒定為真雜交種(圖6)。

利用引物DNtSSR013、引物DNtSSR147和引物DNtSSR150三對特異性SSR引物從131個雜交群體F2代中共鑒定出119個單株為真雜交種，真雜交種單株占雜交群體總數(shù)的91%，因此利用SSR標(biāo)記對石斛雜交群體進(jìn)行真雜交種的鑒定是可行的。在雜交群體F2代中個別單株出現(xiàn)父母本都不具有的新條帶，分析其原因可能是在配子形成過程中，減數(shù)分裂時同源染色體發(fā)生配對和交換或在染色體復(fù)制過程中部分堿基發(fā)生基因突變引起的[10]。

3 小結(jié)與討論

本研究從320對SSR引物中篩選出了3對特異性SSR引物用于鐵皮石斛、金釵石斛2個親本和131個雜交F2代單株真雜交種的鑒定。DNtSSR013、DNtSSR147和DNtSSR150三對特異性引物將雜交群體擴(kuò)增帶型分為真雜交種型、母本型、父本型、缺失型，并從131個雜交群體F2代中鑒定出119個真雜交種，真雜交種占雜交群體的91%。通過多對SSR引物組合能夠快速準(zhǔn)確的鑒定出真雜交種，因此利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定石斛雜交群體是可行的，提高了檢測的準(zhǔn)確度，并為鐵皮石斛和金釵石斛的遺傳圖譜構(gòu)建，石斛多糖和石斛堿等活性成分QTL定位奠定了基礎(chǔ)。