四種污染源氣體顆粒物對(duì)大鼠血清肌紅蛋白和腦鈉肽的影響*

齊鐵雄 石琳 鄭彤 包敏 劉世華 劉艷

(1.首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院心血管內(nèi)科，北京 100020；2.航空總醫(yī)院腎內(nèi)科，北京 100012)

可吸入顆粒物可造成人類的心血管損傷，導(dǎo)致心臟功能降低，引起心血管疾病的發(fā)生率和死亡率增加,檢測(cè)心肌損害有多項(xiàng)生化指標(biāo)，肌紅蛋白(myoglobin,Mb)在哺乳動(dòng)物心肌中含量最高，且被普遍認(rèn)為是影響心肌功能的重要的生化指標(biāo)，是心肌損傷中最早升高的標(biāo)志物之一，具有高度敏感性。腦鈉肽(BNP)是1988年從豬腦中分離出來，主要由心室肌合成并分泌,其合成受到左心室室壁張力和多種神經(jīng)激素作用的調(diào)節(jié),以脈沖方式由冠狀竇釋放入血,主要由腎臟清除[1]。BNP主要作用是抑制交感神經(jīng)的過度反應(yīng)，參與血壓、血容量及鹽平衡的調(diào)節(jié)，從而對(duì)調(diào)節(jié)體液和血壓起到重要作用[2]，被認(rèn)為是一種有意義的心臟病學(xué)標(biāo)志物[3]，Tsutamoto等[4]發(fā)現(xiàn)，腦鈉肽是最好的評(píng)價(jià)心力衰竭預(yù)后的神經(jīng)激素標(biāo)志物。但僅根據(jù)單一標(biāo)志物診斷效果不佳，需聯(lián)合應(yīng)用Mb和BNP可結(jié)合它們不同的診斷優(yōu)勢(shì)，提高診斷效能，對(duì)心臟疾病的診斷具有至關(guān)重要的意義[5]。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及設(shè)備 選用70只清潔級(jí)雄性成年SD大鼠；體質(zhì)量(150±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。室溫22～28℃下飼養(yǎng)，濕度50%～60%，自然光照周期，實(shí)驗(yàn)過程均飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周。采用KL1-e411型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司)，RaytoRT-6100酶標(biāo)儀(深圳雷杜生命科學(xué)有限公司)，Mb及BNP試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程公司。Cell Counting Kit-8 (CCK-8 試劑盒，碧云天)。

1.2 方法

1.2.1 毒物樣品搜集、提取及大鼠呼吸道滴定液的制備 本實(shí)驗(yàn)使用的濾膜為whatman特氟龍有機(jī)濾膜及Air Metric公司生產(chǎn)的便攜式小流量顆粒物采樣器進(jìn)行采樣。

1.2.2 煙霧箱實(shí)驗(yàn)操作 采用小型室外光化學(xué)煙霧箱。箱內(nèi)氣體由特氟龍管，從箱子一側(cè)的出氣口接出，連接采樣器進(jìn)行膜采樣。采用開放式燃燒室。燃燒室為長(zhǎng)方體鐵質(zhì)結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)5m，寬3m，高2m，底部有一鐵托盤，秸稈及煤在鐵托盤上燃燒。燃燒室上部與排煙管道相連，管道末端有一排氣扇，煙氣在排氣扇的作用下抽出。在煙道管前方有一三通，煙氣通過此三通進(jìn)入箱體。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，打開三通末端煙氣進(jìn)氣泵，分別鼓入汽車尾氣、煤煙、燃燒秸稈、自然空氣四種污染源氣體。當(dāng)煙霧箱內(nèi)顆粒物濃度達(dá)到300 ug/m3并穩(wěn)定時(shí)，停止鼓入煙氣，關(guān)閉箱體，顆粒物采樣器開始通過濾膜采集樣品。稱重后加水超聲溶解，配成1mg/ml濃度的顆粒物懸液待滴定。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 將70只雄性成年SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組10只、汽車尾氣組15只、煤煙組15只、燃燒秸稈組15只和自然空氣組15只。實(shí)驗(yàn)組按1mg/ml的相同的濃度氣管內(nèi)分別滴注汽車尾氣、煤煙、燃燒秸稈、自然空氣顆粒的懸液每天1次，一次0.1ml，連滴10天；按0、2、4、6、8和10天6個(gè)時(shí)間點(diǎn)取大鼠眶靜脈血清。在達(dá)到觀察終點(diǎn)后處死全部大鼠，稱體重(bodymass,BM)后，無菌進(jìn)行解剖摘取心臟，稱心臟質(zhì)量(heartmass,HM)，肉眼觀察心臟表觀情況；計(jì)算HM/BM;將心臟組織左室用于病理學(xué)檢測(cè)(10%中性福爾馬林溶液固定)，石蠟包埋、切片，HE染色。病理分析光鏡下進(jìn)行觀察并拍照。鏡下觀察各組大鼠心肌組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、心肌組織損傷、壞死、心肌纖維化等病理改變情況。采用CCK-8法檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞的存活率。細(xì)胞計(jì)數(shù)將含2×103個(gè)細(xì)胞/孔(約100接種于96孔板，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)，向每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)加入10mlCCK8溶液，避光孵育14小時(shí)，以酶標(biāo)儀測(cè)量波長(zhǎng)450nm處吸光度值。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.3 觀察指標(biāo) 每天觀察記錄大鼠的飲食及體重、活動(dòng)力、糞便情況，觀察毛發(fā)、神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)等情況，按6個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察并記錄大鼠一般情況及生存情況，記錄各時(shí)間點(diǎn)大鼠生存數(shù)。取大鼠眶靜脈血清，采用化學(xué)發(fā)光法分別檢測(cè)5組的心損標(biāo)志物肌紅蛋白(Mb)和腦鈉肽(BNP)水平的變化。

2 結(jié)果

2.1 各組實(shí)驗(yàn)開始后6個(gè)時(shí)間點(diǎn)肌紅蛋白(Mb)水平變化 汽車尾氣組、煤煙組和自然空氣組肌紅蛋白(Mb)水平滴入毒物2d后開始升高, 高于其它各組(P<0.05)，三組間無顯著性差異(P>0.05)；滴入毒物的4d達(dá)到峰值,發(fā)病的8d逐漸恢復(fù)至正常值。燃燒秸稈組肌紅蛋白(Mb)水平滴入毒物4d后開始升高, 高于對(duì)照組，有顯著性差異(P<0.05)；滴入毒物的6d達(dá)到峰值,發(fā)病的10d逐漸恢復(fù)至正常值，見表1。

表1 各實(shí)驗(yàn)組肌紅蛋白(U/L)水平的動(dòng)態(tài)變化Table 1 The dynamic changes of myoglobin in each experimental group

2.2 各實(shí)驗(yàn)組6個(gè)時(shí)間點(diǎn)腦鈉肽水平變化 汽車尾氣組、煤煙組和自然空氣組腦鈉肽 (BNP)水平在滴入毒物4d后開始升高, 高于其它各組(P<0.05)，三組間無顯著性差異(P>0.05)；滴入毒物的6d達(dá)到峰值,滴入的10d逐漸恢復(fù)至正常值。燃燒秸稈組腦鈉肽 (BNP)水平滴入毒物4d后開始升高, 高于對(duì)照組，有顯著性差異(P<0.05)；滴入毒物的6d達(dá)到峰值,在其發(fā)病的10d逐漸恢復(fù)至正常值，見表2。

表2 各實(shí)驗(yàn)組腦鈉肽(BNP)(pg/ml)水平的動(dòng)態(tài)變化Table 2 Dynamic changes of brain natriuretic peptide levels in each experimental group

2.3 各實(shí)驗(yàn)組HM/BM和心肌細(xì)胞存活率比較 汽車尾氣組HM/BM明顯升高(P<0.05)，有10例心肌病理出現(xiàn)了輕度的心肌細(xì)胞浸潤(rùn)、水腫、變性。5例出現(xiàn)了嚴(yán)重的心肌細(xì)胞變性、壞死、纖維化；煤煙組HM/BM明顯升高(P<0.05)，有9例心肌病理出現(xiàn)了輕度的心肌細(xì)胞浸潤(rùn)、水腫、變性。6例出現(xiàn)了嚴(yán)重的心肌細(xì)胞變性、壞死、纖維化；自然空氣組HM/BM明顯升高(P<0.05)，有9例心肌病理出現(xiàn)了輕度的心肌細(xì)胞浸潤(rùn)、水腫、變性；6例出現(xiàn)了嚴(yán)重的心肌細(xì)胞變性、壞死、纖維化；三組心肌細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)，均低于秸稈組和對(duì)照組；但三組間無顯著性差別(P>0.05)；秸稈組大鼠HM/BM變化不明顯(P>0.05)，心肌病理出現(xiàn)了輕度的心肌細(xì)胞水腫、變性，HM/BM無明顯升高(P<0.05)，心肌細(xì)胞存活率下降不明顯(P>0.05)，見表3。

表3 各實(shí)驗(yàn)組HM/BM和心肌細(xì)胞存活率Table 3 HM/BM and cardiomyocyte survival rate in each experimental grou

3 討論

實(shí)驗(yàn)中，我們選擇了血清肌紅蛋白(Mb)和腦鈉肽 (BNP)作為判斷大鼠心肌損害檢驗(yàn)指標(biāo)。肌紅蛋白(Mb)存在于哺乳動(dòng)物Ⅰ型、Ⅱa型骨骼肌或心肌組織細(xì)胞質(zhì)中，是一種重要的細(xì)胞內(nèi)色素蛋白。有研究表明[6]，Mb能夠促進(jìn)組織內(nèi)的氧供應(yīng)，具有氧轉(zhuǎn)運(yùn)載體、細(xì)胞內(nèi)催化劑和氧儲(chǔ)存等功能，在參與心肌和骨骼肌細(xì)胞的氧供應(yīng)和氧消耗中發(fā)揮重要作用[7]，在心肌損傷的早期釋放入血。Mb在血中出現(xiàn)早與其分子量很小有關(guān)，能迅速自損傷部位釋放進(jìn)入血液循環(huán)，從而使血清中肌紅蛋白的水平明顯升高。有實(shí)驗(yàn)表明，缺氧環(huán)境下的MbKO小鼠心臟功能障礙是有NO介導(dǎo)的，從而間接證明Mb具有細(xì)胞內(nèi)NO水平調(diào)控作用[8]。腦鈉肽(BNP)是生理和病理狀況下維持心腎系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的重要物質(zhì)。可與其受體結(jié)合，刺激鳥苷酸環(huán)化酶而抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的縮血管作用，抑制交感神經(jīng)的過度反應(yīng)，降低血漿腎素和醛固酮的濃度，促進(jìn)血管的松弛，在容量負(fù)荷過多的時(shí)候產(chǎn)生利鈉、利尿、血管擴(kuò)張、血壓下降的效應(yīng)[9-11]，當(dāng)心室負(fù)荷改變和心肌受牽張及心肌受到損傷時(shí)，BNP合成和分泌增加，并大量釋放進(jìn)入血液[12]。有研究認(rèn)為，輕度牽拉心室即可使BNP的mRNA表達(dá)增高，合成增多，當(dāng)出現(xiàn)心功能不全時(shí)，心室腦鈉肽mRNA快速轉(zhuǎn)錄，突發(fā)性合成BNP，表明BNP可以作為左室功能障礙敏感性和特異性的指標(biāo)[13-14]，且BNP釋放與心室擴(kuò)張和壓力負(fù)荷成正比[15-16]。BNP也是缺血標(biāo)志物，即使沒有心肌壞死的情況下，心肌缺血也能使BNP水平升高。Mukoyama等[17]報(bào)道，慢性心力衰竭患者血漿腦鈉肽水平較正常升高，且與心衰嚴(yán)重程度呈正比。Chang等[18]進(jìn)一步提出BNP及其前體作為心力衰竭標(biāo)記物，其診斷價(jià)值明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的診斷方法。在鑒別心力衰竭與其他原因引起的呼吸困難時(shí)，腦鈉肽水平的升高比左心室射血分?jǐn)?shù)和心鈉肽、N末端殘片腦鈉肽更準(zhǔn)確及敏感，其敏感度>90%，其特異性為80～90%[19-20]。BNP在心臟功能受損時(shí)會(huì)顯著增大分泌量和加快分泌速度，能有效調(diào)節(jié)血容量和心臟功能。因此,BNP可能有助于保護(hù)心功能[21-22]。BNP還能減少血管收縮肽產(chǎn)生而促進(jìn)血管舒張肽的釋放從而抗冠狀動(dòng)脈痙攣，可使血管平滑肌松弛，降低血壓，減輕心臟的前負(fù)荷；抑制心肌細(xì)胞纖維化、血管平滑肌細(xì)胞增生以及纖維化；抗心肌細(xì)胞脂肪分解、抗心肌成纖維細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞增殖，抑制心肌細(xì)胞肥大、增生；抑制某些激素的活性；此外，還參與凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)調(diào)節(jié)，減少內(nèi)皮功能損傷。腦鈉肽清除有兩種途徑：結(jié)合受體或通過中性內(nèi)肽酶(neutral endopeptidase NEP)使其滅活[23]。研究中還發(fā)現(xiàn):各研究組大鼠血清肌紅蛋白(Mb)和肌酸激酶同工酶(BNP)的水平均明顯高于對(duì)照組大鼠,二者相比差異具有顯著性。各研究組大鼠血清中Mb的水平在其滴入毒物后均有升高，均在一定時(shí)間內(nèi)達(dá)到峰值,在實(shí)驗(yàn)期間逐漸恢復(fù)至正常值。血清中BNP水平也存在此類波動(dòng)變化，BNP達(dá)到峰值的時(shí)間及逐漸恢復(fù)至正常值的時(shí)間比Mb水平晚，但升高的幅度更高。汽車尾氣組、煤煙組和自然空氣組大鼠引起的心肌損害最嚴(yán)重，而汽車尾氣的主要成分是一氧化碳、碳?xì)浠衔铩⒌趸铩⒍趸蚝鸵恍┲亟饘伲幻簾煹闹饕煞质翘肌洹⒀酢⒌傲颉⒘住⒎⒙群蜕椋蛔匀豢諝饨M的主要成分為硫酸鹽、硅酸鹽、硝酸鹽及多種重金屬的混合物；說明這些物質(zhì)引起的心肌細(xì)胞損傷較強(qiáng)；燃燒秸稈組引起心肌細(xì)胞損傷較弱；以上三組均出現(xiàn)了嚴(yán)重的心肌細(xì)胞變性、壞死、纖維化；HM/BM明顯升高；心肌細(xì)胞存活率明顯降低。而燃燒秸稈的主要成分是碳酸鉀、氯化鉀、氯化鎂，說明這些成分造成的心肌細(xì)胞損害較弱。心肌病理出現(xiàn)了輕度的心肌細(xì)胞水腫、變性，HM/BM無明顯升高(P<0.05)，心肌細(xì)胞存活率下降不明顯(P>0.05)。

4 結(jié)論

本資料顯示，氣管內(nèi)滴入汽車尾氣、煤煙、燃燒秸稈、自然空氣顆粒的大鼠，血清中肌紅蛋白和腦鈉肽水平明顯升高。高濃度的汽車尾氣、煤煙、燃燒秸稈、自然空氣顆粒均可以引起心肌損害，參與了心肌損害過程。檢測(cè)大鼠血清中肌紅蛋白和腦鈉肽的水平對(duì)判斷污染物對(duì)大鼠心肌損害程度具有重要意義。