Sleeping Beauty轉座子介導敲低PEX2轉基因載體的構建

孫瀟 蔡夢嬌 張丹 韓蘇夏

(西安交通大學第一附屬醫院腫瘤放療科，陜西 西安710061)

轉座子(Transposon)是一類可以在基因組中改變自身位置的DNA序列，改變位置的過程被稱為轉座(transposition)。睡美人(Sleeping Beauty，SB)轉座子屬于 Tcl/mariner 家族，近幾年在哺乳動物中研究較為廣泛。SB轉座系統包括兩端攜帶反向重復序列(inverted terminal repeat , ITR)的轉座子和編碼轉座酶的序列，可以進行“剪切粘貼”的轉座過程，即通過轉座酶識別轉座子兩端的反向重復序列將其剪切，介導轉座子整合到基因組中新的位點[1]。SB轉座系統的應用為基因研究的體外和體內實驗提供了新的基因編輯技術。 Magnani CF等利用SB轉座系統將含有CD19CAR的轉座子插入到細胞因子誘導型殺傷細胞(cytokine-induced killer cell，CIK cell)的基因組中，形成CARCIK-CD19細胞，并對該細胞治療急性淋巴細胞白血病進行臨床前療效和安全性評估[2]。Gao B等應用SB轉座系統構建骨骼肌細胞特異性高表達mIGF-1的小鼠模型，發現 mIGF-1在小鼠骨骼肌中過度表達可促進肌纖維肥大和肌肉產生，并提高成年小鼠的平均體重[3]。Chow EK等結合SB轉座子系統和水動力法尾靜脈注射(Hydrodynamic tail vein injection, HTVI)在小鼠肝臟中通過過表達原癌基因Myc誘導肝癌形成[4]。

通過基于CRISPR/Cas9的高通量負向篩選技術和自主構建的靶向泛素蛋白酶體系統相關基因的sgRNA亞文庫對人肝癌HepG2細胞株進行高通量負向篩選(見圖1)，發現過氧化物酶體生物合成因子2(Peroxisomal Biogenesis Factor 2，PEX2)敲除后可以抑制HepG2細胞生長。PEX2是過氧化物酶體的一種膜蛋白，與PEX10、PEX12構成E3泛素連接酶復合體，通過泛素化PMP70和PEX5參與過氧化物酶體自噬活動[5]。進一步研究發現PEX2基因的缺失可導致肝癌細胞中過氧化物酶體功能喪失、多種代謝途徑紊亂，同時可抑制mTOR(The mammalian target of rapamycin)信號轉導通絡，最終引起肝癌(Liver cancer)細胞發生自噬和死亡[6]。

為進一步了解PEX2在體內對肝癌發生發展的作用，我們運用睡美人( Sleeping Beauty, SB) 轉座系統構建小鼠肝癌模型，即通過水動力法尾靜脈注射向小鼠肝臟導入攜帶原癌基因MYC的轉座子質粒pT3EF1α-c-Myc和表達轉座酶SB100X的pCMV(CAT)T7-SB100 質粒，其中轉座酶通過識別轉座子中MYC表達結構兩側的反向重復序列，將其剪切并整合到小鼠肝臟細胞的基因組中，可以實現MYC在整合細胞中的穩定表達。運用該種方法成功地在小鼠體內誘導出肝癌。隨后，我們構建了同時含有針對PEX2的shRNA序列或對照shNC序列和原癌基因MYC的重組轉座子系統，以探索PEX2在體內對肝癌形成的影響。

圖1 基因篩選模式圖Figure 1 Genetic screening model

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌株、細胞和小鼠 質粒pT3EF1α-c-Myc,pCMV(CAT)T7-SB100 購自Addgene公司。質粒pLKO.1-shNC和pLKO.1-shPEX2由北京國家蛋白質研究中心分子遺傳實驗室保存。大腸桿菌Mach1-T1感受態細胞購自博邁德公司。小鼠肝癌細胞株Hepa1-6由北京國家蛋白質研究中心分子遺傳實驗室保存。6-8周齡小鼠FVB購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.2 工具酶和試劑 各種內切酶和 T4 連接酶均購自 NEB公司， 質粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒為OMEGA品牌，Lipofectamine 2000 購自Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 方法

1.2.1 載體pT3EF1α-GFP的構建 以載體pENTRY-EF1α-GFP-Mir為模板、F-EF1α-GFP-AgeI和R-EF1α-GFP-Not I為引物PCR擴增EF1α-GFP序列(見表1)，瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收PCR產物。PCR 反應體系為：1μL pENTRY-EF1α-GFP-Mir、1.5μL引物、25μL 2×PCR Buffer for KOD FX、10μL 2mM dNTPs、1μL KOD FX、10μL ddH2O。反應條件為：94℃預變性 2min；先 98℃變性 10s、 64℃退火 20s、 68℃延伸 90s，重復變性、退火、延伸30個循環；最后68℃延伸 10min 終止反應。

用AgeI 和Not I同時酶切載體pT3EF1α-c-Myc和EF1α-GFP片段，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切產物，并對產物進行T4連接，獲得目標載體pT3EF1α-GFP。酶切體系為：40μL pT3EF1α-c-Myc或EF1α-GFP片段、5μL cutsmart、2μL AgeI、2μL Not I、1μL ddH2O。T4連接體系：0.5μL 酶切后pT3EF1α-c-Myc、1.5μL 酶切后EF1α-GFP片段、0.5μL T4連接酶、0.5μL T4連接緩沖液、2μL ddH2O。對獲得的載體進行轉化、挑取單克隆、提質粒并進行測序，以鑒定載體的正確性。質粒提取嚴格按照OMEGA小提試劑盒步驟進行操作。質粒測序委托北京擎科新業生物有限公司進行。

1.2.2 質粒表達檢測 小鼠肝癌細胞Hepa1-6接種于6孔培養板中，待密度為40%～60%時，用Lipofectamine 2000進行質粒轉染，pT3EF1α-c-Myc和pT3EF1α-GFP質粒各轉染2μg，并于48小時后收取樣品，提取RNA，通過qPCR實驗測定載體pT3EF1α-c-Myc和pT3EF1α-GFP中MYC的表達。

1.2.3 SB轉座子介導的MYC過表達誘導小鼠肝癌預實驗 實驗組與對照組各五只FVB小鼠，對照組注射轉座子質粒 pT3EF1α-GFP和轉座酶SB100X表達載體pCMV(CAT)T7-SB100 ；實驗組注射轉座子質粒 pT3EF1α-c-Myc和轉座酶SB100X表達載體pCMV(CAT)T7-SB100 。質粒使用量為：20μg/只，其中轉座子與轉座酶載體比例為25∶1。質粒溶于格林溶液。注射方法采用水動力法尾靜脈注射(Hydrodynamic tail vein injection, HTVI)，即在5～9s內將質粒溶液通過小鼠尾靜脈注射入小鼠體內。

1.2.4 載體pT3EF1α-c-Myc-shNC、pT3EF1α-c-Myc-shPEX2的構建 設計合成小鼠PEX2基因的shRNA序列shPEX2以及對照組shNC(見表2)，并將其連接入載體pLKO.1中構建pLKO.1-shPEX2、pLKO.1-shNC載體。在小鼠肝癌細胞Hepa1-6中驗證其敲低PEX2的作用。以載體pLKO.1-shNC和pLKO.1-shPEX2為模板，F-U6-shNC-NsiI、R-U6-shNC-PacI和 F-U6-shPEX2-NsiI、R-U6-shPEX2-PacI為引物擴增U6-shNC和U6-shPEX2片段(見表1)，瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收PCR產物。PCR 反應體系為： 1μL pLKO.1-shNC載體或pLKO.1-shPEX2、1.5μL引物、 25μL 2×PCR Buffer for KOD FX、10μL 2mM dNTPs、1μL KOD FX、10μL ddH2O。反應條件為：94℃預變性 2min；先 98℃變性 10s、 64℃退火 20s、 68℃延伸 20s，重復變性、退火、延伸30個循環；最后68℃延伸 10min 終止反應。

用NsiI 和PacI同時酶切載體pT3EF1α-c-Myc和U6-shNC、U6-shPEX2片段，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切產物，并對產物進行T4連接，獲得目標載體pT3EF1α-c-Myc-shNC和pT3EF1α-c-Myc-shPEX2。酶切體系:40μL pT3EF1α-c-Myc或U6-shNC片段或U6-shPEX2片段、5μL cutsmart、2μL NsiI、2μL PacI、1μL ddH2O。T4連接體系：0.5μL 酶切后pT3EF1α-c-Myc、1.5μL 酶切后U6-shNC片段或U6-shPEX2片段、0.5μL T4連接酶、 0.5μL T4連接緩沖液、2μL ddH2O。

對上述獲得的載體進行轉化、挑取單克隆、提質粒并進行測序，以鑒定載體的正確性。質粒提取嚴格按照OMEGA小提試劑盒步驟進行操作。質粒測序委托北京擎科新業生物有限公司進行。

1.2.5 pT3EF1α-c-Myc-shNC、pT3EF1α-c-Myc-shPEX2質粒表達檢測 小鼠肝癌細胞Hepa1-6接種于 6 孔培養板中，待密度為40%-60%時，用Lipofectamine 2000進行質粒轉染，每種質粒各轉染2μg，并于48小時后收取樣品，提取RNA，通過qPCR實驗測定實驗組載體pT3EF1α-c-Myc-shPEX2的表達是否實現PEX2基因的敲低。

表1 載體構建引物Table 1 The primers for vector

表2 shRNA序列Table 2 The sequence of shRNA

2 結果

2.1 載體pT3EF1α-GFP的構建 以載體pENTRY-EF1α-GFP-Mir為模板擴增EF1α-GFP片段，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條帶清晰可見，并且與預期一致，大小為1919bp(見圖2A)。用AgeI 和NotI同時酶切載體pT3EF1α-c-Myc和EF1α-GFP片段，然后進行瓊脂糖凝膠回收，并用T4連接酶對產物進行連接，通過轉化對載體進行篩選，挑取單克隆并提取質粒進行酶切和測序以鑒定載體的正確性。酶切鑒定顯示pT3EF1α-GFP經AgeI 和NotI酶切后，獲得大小為3935bp和1912bp的條帶(見圖2B)，并且測序結果顯示GFP與原序列吻合，說明克隆所得的載體 pT3EF1α-GFP正確。

圖2 PCR產物(A)與質粒pT3EF1α-GFP酶切鑒定(B)

Figure2TheproductsofPCR(A)andDetectionofpT3EF1α-GFPvector(B)

2.2 pT3EF1α-GFP和pT3EF1α-c-Myc載體中MYC基因的表達情況 用Lipofectamine 2000轉染法分別將2μg轉座子質粒pT3EF1α-GFP和pT3EF1α-c-Myc轉染入小鼠肝癌細胞Hepa 1-6中，并于48小時后收取樣品提取RNA檢測RNA水平MYC基因的表達情況。結果顯示，載體pT3EF1α-c-Myc中存在MYC表達，而載體pT3EF1α-GFP中無MYC表達。表明可用pT3EF1α-GFP轉座子作為對照，以比較顯示原癌基因MYC誘導肝癌形成的作用，見圖3。

2.3 SB轉座子介導的MYC過表達誘導小鼠肝癌預實驗 借助SB轉座子系統在肝臟細胞中通過過表達原癌基因MYC以誘導肝癌形成。向實驗組注射攜帶MYC基因的pT3EF1α-c-Myc轉座子質粒和表達轉座酶SB100X的pCMV(CAT)T7-SB100 質粒，轉座酶通過識別轉座子載體中MYC表達結構兩側的反向重復序列(ITRs)，將其剪切并重新整合到小鼠肝臟細胞的基因組中，可以實現MYC在整合細胞中的穩定表達。對照組注射攜帶對照基因GFP的pT3EF1α-GFP轉座子質粒和表達轉座酶SB100X的pCMV(CAT)T7-SB100 質粒,以相同的機制，最終被整合入小鼠肝臟細胞基因組中的為GFP基因。實驗結果顯示，從注射后第5周開始，實驗組小鼠出現荷瘤死亡，而對照組小鼠未見成瘤(見圖4)。我們成功誘導出肝癌，證明SB轉座系統介導的MYC過表達誘導肝癌形成技術可行。

圖3 質粒pT3EF1α-GFP與pT3EF1α-c-Myc中MYC的表達

Figure3ExpressionofMYCinpT3EF1α-GFPandpT3EF1α-c-Myc

圖4 SB轉座系統介導MYC誘導小鼠肝癌形成

Figure4SBtransposonmediatedMYC-inducedlivercancerformationinmice

注：A.小鼠正常肝臟組織；B.小鼠肝癌組織

2.4 載體pT3EF1α-c-Myc-shNC、pT3EF1α-c-Myc-shPEX2的構建 集落形成實驗顯示以pLKO.1-shNC為對照，載體pLKO.1-shPEX2在小鼠細胞Hepa1-6中敲低PEX2有效，可抑制該細胞的增殖(見圖5)，證明該shPEX2序列可用。然后以載體pLKO.1-shNC和pLKO.1-shPEX2為模板擴增U6-shNC和U6-shPEX2片段，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條帶清晰可見，并且與預期一致，U6-shNC大小為318bp，U6-shPEX2大小為322bp(見圖6A)。用NsiI 和PacI同時酶切載體pT3EF1α-c-Myc和U6-shNC、U6-shPEX2片段，然后進行瓊脂糖凝膠回收，并用T4連接酶對產物進行連接，通過轉化對載體進行篩選，挑取單克隆并提取質粒進行酶切和測序以鑒定載體的正確性。酶切鑒定顯示載體pT3EF1α-c-Myc-shNC和pT3EF1α-c-Myc-shPEX2經NsiI 和PacI酶切后，pT3EF1α-c-Myc-shNC獲得大小為6472 bp和310 bp兩個條帶，pT3EF1α-c-Myc-shPEX2獲得大小為6472 bp和314 bp兩個條帶(見圖6B)，并且測序結果顯示U6-shNC和U6-shPEX2與原序列吻合，說明克隆所得的載體pT3EF1α-c-Myc-shNC、pT3EF1α-c-Myc-shPEX2正確，載體圖譜，見圖7。

2.5 載體中PEX2基因的敲低情況 用Lipofectamine 2000轉染法分別將2μg轉座子質粒轉染小鼠肝癌細胞Hepa 1-6，并于48小時后收取樣品提取RNA檢測RNA水平上PEX2基因的敲低。結果顯示，載體pT3EF1α-c-Myc-shPEX2相較于對照載pT3EF1α-c-Myc-shNC，PEX2基因敲低約40%，見圖8。

3 討論

肝癌是目前全球癌癥相關死亡的第二大常見原因[7]，成功構建肝癌動物模型，對探索影響肝癌形成的分子功能進而研究人類肝癌的發生發展具有重要現實意義。小鼠因遺傳物質跟人類相似，有繁殖能力強、生命周期短、基因修飾方便等特點，成為重要的模式生物。通過多種方法構建小鼠肝癌模型，可為研究肝癌相關的藥物篩選、肝癌發生機制等提供實驗載體。利用化學物質可誘發肝癌形成，匡志鵬等通過聯合采用二甲基亞硝胺(DEN)/四氯化碳(CCl4)/乙醇成功誘導C57BL/6J小鼠肝癌形成[8]。Vartanian V等運用黃曲霉毒素(AFB1)誘導出小鼠肝癌[9]。化學物質誘發肝癌雖在研究中多見，但其致死率較高，并且誘發時間較長。借助人類或者小鼠肝癌組織或者肝癌細胞可構建小鼠移植肝癌模型。移植部位常見于背側皮下，肝臟等。張建民等采用直接注射法，將鼠肝癌H22細胞注射入小鼠肝臟，術后兩周觀察發現實驗小鼠均可見腫瘤生長[10]。采用移植法構建小鼠肝癌模型成瘤率高，實驗周期短且個體差異小，但也存在問題。皮下移植瘤因缺乏肝臟特異的生長環境，導致皮下移植腫瘤的生物學行為與肝臟原位腫瘤存在差異，同時移植瘤多構建在免疫力缺陷的裸鼠身上，因此此種模型不適用于肝癌發展與免疫之間關系的研究。隨著轉基因技術的發展，借助轉基因技術構建小鼠肝癌模型也應運而生。人類肝癌的80%是由乙型肝炎病毒(HBV)和或丙型肝炎病毒感染(HCV)所致，借助轉基因技術，已成功構建出攜帶肝炎病毒編碼基因的小鼠模型。Chisari FV等通過向單個小鼠受精卵中顯微注射含有HBV表面抗原(HBsAg)和前S和X抗原編碼區的HBV DNA亞基因組片段，成功構建HBV基因攜帶的小鼠模型[11]。Kyoji Moriya等構建的HCV核殼蛋白轉基因小鼠，在16個月的時候發展出肝細胞癌[12]。HBV、HCV慢性攜帶小鼠模型的構建，有助于肝炎病毒相關的肝臟疾病的研究。同時，結合轉基因技術將原癌基因導入小鼠肝臟組織，通過原癌基因的表達作用誘導正常肝臟細胞癌變，最終形成肝癌的方法也已成功實現。B Xin等借助水動力尾靜脈注射(HTVi)技術和SB轉座子系統，將AKT和HRAS基因導入C57BL/6J小鼠肝臟細胞中，并于大約8周時誘導出肝癌[13]，并且發現MYC基因的活化在AKT和HRAS基因誘導肝癌形成中起著重要作用。Pin Liu等借助水動力尾靜脈注射(HTVi)技術和SB轉座子系統，將原癌基因myc導入FVB/N 小鼠肝臟細胞中，注射后約6周小鼠出現荷瘤死亡，同時發現mTORC1信號通路活化在MYC誘導小鼠肝癌形成中的關鍵作用[14]。通過水動力尾靜脈注射(HTVi)技術將質粒注射入小鼠體內，其中肝臟為質粒的主要獲取器官，心臟、肺、腎、脾等的質粒獲取不足肝臟獲取的0.1%，約10%～40%肝臟細胞可獲取質粒[15]，因此水動力尾靜脈注射可達到很好的肝臟靶向性。利用SB轉座子技術可實現目標基因在宿主基因組中的整合，以實現目的基因是長期穩定表達。結合這兩種技術可將目的基因整合入肝臟細胞，但最終獲取并能穩定表達目的基因的肝臟細胞只有2%～10%[15]。腫瘤細胞周圍圍繞正常肝臟細胞，更加符合人類肝癌的發展模式。借助水動力尾靜脈注射(HTVi)技術和SB轉座子系統使肝臟細胞過表達原癌基因MYC，從而誘發肝癌形成的方法現已比較成熟，并且操作方便、實驗周期短。需要注意的是，遵照SB轉座子系統的機制，構建重組轉座子時，為實現目標序列能夠被整合到受體基因組中，重組序列必須插入在兩側反向重復序列之間。

圖5 shPEX2的表達可抑制Hepa1-6細胞的增殖Figure 5 The expression of shPEX2 can inhibit the proliferation of Hepa1-6 cells

圖6 PCR產物(A)；pT3EF1α-c-Myc-shNC、pT3EF1α-c-Myc-shPEX2酶切鑒定(B)Figure 6 The products of PCR (A) ； Detection of pT3EF1α-c-Myc-shNC vector and pT3EF1α-c-Myc-shPEX2 vector (B)

圖7 質粒pT3EF1α-c-Myc和pT3EF1α-c-Myc-shRNA圖譜Figure 7 Map of pT3EF1α-c-Myc and pT3EF1α-c-Myc-shRNA

圖8質粒pT3EF1α-c-Myc-shPEX2可減少Hepa1-6細胞中PEX2的表達

Figure8PlasmidpT3EF1α-c-Myc-shPEX2ReducesPEX2ExpressioninHepa1-6Cells

4 結論

本研究借助 HTVI技術和SB轉座系統過表達c-Myc成功誘導小鼠肝癌形成，并在SB轉座子質粒pT3EF1α-c-Myc基礎上成功構建了可在小鼠肝癌細胞Hepa1-6中敲低PEX2基因的重組轉基因載體，以探索PEX2在體內對肝癌發生發展的影響。