分枝桿菌噬菌體DNAⅢ生物學特性及其抗耐藥結核潛力*

鄔亭亭 劉平 郭術良 魏強 羅永艾

(1.成都市第三人民醫院呼吸內科，四川 成都 610031；2.重慶醫科大學附屬第一醫院呼吸與危重癥醫學科，重慶 400016；3.重慶市長壽區人民醫院呼吸內科，重慶 401220；4.成都市天府新區人民醫院內二科，四川 成都 610213)

我國是全球結核高負擔國家之一。結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)耐藥形勢嚴峻。耐藥結核病的流行嚴重威脅我國結核病的防治工作，已經成為我國結核防控關注重點。噬菌體是一種細菌依賴性病毒，可以裂解細菌，具備抗菌潛力。噬菌體治療銅綠假單胞菌等耐藥菌屬獲得成功[1，2]的報道提示，分枝桿菌噬菌體具備治療耐藥結核病的潛力，為耐藥結核病治療提供新思路。本文研究分枝桿菌噬菌體DNAⅢ的生物學特性和抗耐藥MTB的作用，為抗耐藥MTB噬菌體雞尾酒療法提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 ①噬菌體及其宿主菌 噬菌體TM4由美國匹茲堡大學Hutful教授惠贈；噬菌體DNAⅢ、Sedeg、Legendre、33D、BO4、Clark和Leo由加拿大Laval大學贈送；噬菌體D29和恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis ,MS) mc2155由中國藥品生物制品檢定所王國治教授贈送；分枝桿菌臨床株由本課題組2010年5月～2011年4月期間從重慶醫科大學附屬第一醫院結核病人痰中分離，比例法檢測藥敏；MTB H37Rv購于重慶市肺科醫院。②主要試劑：OADC增菌液(美國sigma公司)，7H9/7H10培養基(美國BD公司)，福氏完全佐劑(美國sigma公司)，羅氏培養基(珠海貝索公司)。實驗動物:新西蘭大耳白兔(符合倫理要求)由重慶醫科大學實驗動物中心提供

1.2 方法

1.2.1 噬菌體的制備及噬菌斑觀察 參照文獻方法[3]，采用雙層瓊脂培養法制備噬菌體，次日觀察噬菌斑。

1.2.2 透射電鏡 根據λ噬菌體提取方法[4]，取20 uL純化的噬菌體DNAⅢ液滴于銅網上，15min自然沉降后，加磷鎢酸(20 g/L，pH7.0)10ul于銅網上染色10 min，透射電鏡觀察顆粒形態。

1.2.3 最佳感染復數(muitiplicity of infection，MOI)的測定 參照文獻方法[5]，設置不加宿主菌的噬菌體和不加噬菌體的宿主菌為對照組，重復實驗三次，每個MOI做兩份取平均值。測定最小MOI(噬菌體感染宿主菌 24 h后全部MS被裂解的MOI)和最佳MOI(產生最高噬菌體滴度的MOI)。

1.2.4 一步生長曲線 參照文獻方法[6]，設置對照組(①不加宿主菌的噬菌體;②不加噬菌體的宿主菌)，各時間點均作兩份復管取平均值，重復實驗三次。繪制噬菌體DNAⅢ一步生長曲線，根據裂解量計算公式計算DNAⅢ裂解量。

1.2.5 噬菌體理化穩定性實驗 ①噬菌體的熱穩定性檢測實驗：將滴度為1010pfu/mL的DNAⅢ噬菌體原液分別置于37℃、60℃、70℃恒溫水浴箱中溫浴1 h，15 min取樣一次，立即冰浴至室溫，測定噬菌體滴度。②噬菌體的pH穩定性檢測實驗：分別取4.5ml不同pH的7H9液加入試管中，置于25℃的恒溫水浴箱中，溫度恒定后加入0.5 mL的DNAⅢ原液，恒溫1 h，測定噬菌體滴度。③不同pH值環境下噬菌體裂解能力實驗：將10 uL DNAⅢ液加入到MS中(0.2 mL，對數生長期)，混勻后共孵育10min。制備pH為7.4和5的培養平板，雙層平板培養法培養。

1.2.6 噬菌體寬噬實驗 雙層瓊脂培養基上分別制成均勻的菌苔(宿主菌：分枝桿菌各臨床分離株)。在菌苔上滴加1×109pfu/mL的DNAⅢ噬菌體液，37℃培養箱培養，6～8周后觀察結果。

1.2.7 血清中和實驗和交叉中和實驗 ①DNAⅢ抗血清制備：按方法[5]制備抗血清。②血清中和實驗：按照文獻[7]方法，測定抗DNAⅢ血清K值。

式中D是抗血清稀釋度，P為經t分鐘后測定的噬菌體滴度，P0為未加抗血清時測定的噬菌體滴度，本實驗中t=5。③血清交叉中和實驗：按照文獻[7]方法，8株噬菌體與DNAⅢ的抗血清進行交叉中和試驗，根據上述公式計算K值。

2 結果

2.1 噬菌體DNAⅢ噬菌斑及噬菌體透射電鏡

2.1.1 DNAⅢ噬菌斑形態：平均直徑約為1 mm，圓形透明，見圖1-A。

2.1.2 噬菌體透射電鏡：由透射電鏡(見圖1-B)可見噬菌體DNAⅢ顆粒由一個長多面體立體對稱的頭部和尾部組成，頭部直徑(57±8.9 )nm，尾長(208±28.7 )nm。分枝桿菌噬菌體DNAⅢ為長尾噬菌體。

2.2 噬菌體DNAⅢ最佳MOI、最低MOI測定 DNAⅢ產生最多子代噬菌體的M0I為0.0001，為噬菌體DNAⅢ的最佳MOI；M0I分別為10、1、0.1、0.01和0.001時，共培養24 h后，所有宿主菌MS被裂解，DNAⅢ感染MS的最低MOI為0.001，見表1。

2.3 噬菌體DNAⅢ一步生長曲線 噬菌體DNAⅢ感染MS的潛伏期為165 min。根據裂解量計算公式計算噬菌體DNAⅢ感染MS的裂解量為28，見圖2。

2.4 噬菌體理化穩定性實驗

2.4.1 噬菌體DNAⅢ熱穩定性實驗：顯示噬菌體DNAⅢ對熱敏感，70℃恒溫加熱15min即可滅活全部DNAⅢ，見圖3A。

圖1 噬菌體DNAⅢ噬菌斑(A)及噬菌體DNAⅢ透射電鏡圖(B)Figure 1 Plaques produced of phage DNAⅢ (A) and electron micrograph of DNAⅢ (B)

圖2 分枝桿菌噬菌體DNAⅢ的一步生長曲線Figure 2 One-step growth curve for phage DNAⅢ

2.4.2 噬菌體DNAⅢ pH穩定性實驗：顯示在酸堿環境明顯影響DNAⅢ的存活率，pH12.0時和pH4.0時DNAⅢ的存活率均為0，見圖3B。

2.4.3 不同pH值環境下噬菌體裂解能力實驗：PH值為5的環境下依然有部分噬菌體能裂解宿主菌，據此推測DNAⅢ不僅能裂解體液中的宿主菌，還有可能裂解巨噬細胞中的宿主菌,見圖4。

2.5 噬菌體DNAⅢ寬噬實驗 實驗證實DNAⅢ不能有效裂解耐藥分枝桿菌臨床分離株，對耐藥結核分枝桿菌的裂解率達78.26%。噬菌體DNAⅢ是寬噬噬菌體，見表2。

圖3 溫度(A)、酸堿(B)對噬菌體DNAⅢ活力的影響Figure 3 Effects of temperature and pH on livability of phage DNAⅢ.

圖4 pH值對噬菌體DNAⅢ裂解能力的影響Figure 4 Effects of pH on lysing of phage DNAⅢ

表2 噬菌體DNAⅢ裂解譜實驗Table 2 Broad lysing experiment of phage DNAⅢ

注：XDR-TB：extensively drug resistant tuberculosis，泛耐藥結核菌；MDR-TB：Multidrug-Resistant Tuberculosis，多重耐藥結核菌。

2.6 血清中和實驗及交叉中和實驗 抗DNAⅢ血清稀釋1000倍后仍能有效中和DNAⅢ對宿主菌的吸附與感染(K=770.01)，但只稀釋10倍時才能中和Legendre, BO4和33D對宿主菌的吸附與感染；原液才能中和噬菌體Sedge和Leo對宿主菌的吸附與感染；DNAⅢ抗血清不能綜合D29對宿主菌的吸附與感染，見表3。

表3噬菌體DNAⅢ抗血清中和實驗和交叉中和實驗

Table3NeutralizationtestandcrossneutralizationtestofphageDNAⅢ

噬菌體抗DNAⅢ 血清DP0PKLegendre10303493.64TM4100222480BO41015268 1.61Sedgeundiluted24460.7233D10217323.82Clark252961913.71Leoundiluted305210.53D29undiluted244210-DNAⅢ10002365770.01

注：D. 抗血清稀釋度; P0. 未加抗血清時測定的噬菌體滴度; P. 經5 min后測定的噬菌體滴度

3 討論

目前結核病的主要治療方式為化療。50年沒有突破性的抗結核新藥問世，結核藥物研發嚴重滯后。面對龐大的結核病患病人數和死亡人數的嚴峻現實，急需開發新的抗結核治療藥物。

分枝桿菌噬菌體能夠裂解結核分枝桿菌，有望用于耐藥結核病的治療[8]。作為目前研究最詳細的分枝桿菌噬菌體，Ford等于1998年已完成D29的全基因組測序。國內已有幾個研究團隊將D29用于結核病的治療[9-10]，同時發現MTB對D29耐藥現象。細菌對噬菌體快速耐藥變異，一直是噬菌體療法難以推廣的巨大阻礙[11]。國外已有研究成功利用噬菌體"雞尾酒療法"治療其他細菌感染，噬菌體"雞尾酒療法"不僅能提高噬菌體殺菌療效，還能延緩細菌對噬菌體產生耐藥性[1,12-14]。綜合之前的研究，本課題組提出分枝桿菌噬菌體"雞尾酒療法"抗耐藥MTB的科學構想。通過從國外引進和自主分離多株分枝桿菌噬菌體，用于篩選"雞尾酒療法"的噬菌體配方。通過研究分枝桿菌噬菌體DNAⅢ基本生物學特征，篩選宿主譜寬，無交叉吸附表位的分枝桿菌噬菌體，為分枝桿菌噬菌體雞尾酒療法抗耐藥MTB研究提供實驗依據。

烈性噬菌體能在宿主菌體內迅速增殖并裂解細菌。噬菌體DNAⅢ的噬菌斑透明清晰，為烈性噬菌體的噬菌斑特征。Pedulla等的實驗[15]和我們的前期實驗[16]發現長尾噬菌體能殺滅休眠菌。這是因為長尾噬菌體的卷尺蛋白具有Motif 3基序，該基序能促進休眠菌復蘇。因此我們有理由相信長尾噬菌體科噬菌體DNAⅢ也具備殺滅MTB休眠菌的潛力，為減少結核病復發提供新思路[17]。

通過最佳MOI的測定，本研究發現少量噬菌體DNAⅢ與宿主菌共培養即可提供噬菌體療法所需的大量噬菌體。通過最低MOI的測定發現DNAⅢ對MS極度易感。

噬菌體DNAⅢ感染MS的潛伏期是165 min，同我們前期對分枝桿菌噬菌體LEO、chy1、BO4一步生長曲線類似[18-20]，較以往報道過碳青霉烯類鮑曼不動桿菌噬菌體[21]和鼠疫菌噬菌體[22]的生長周期長。分枝桿菌噬菌體潛伏期長，可能是因宿主菌增殖慢導致。張劼等研究者[21]認為噬菌體裂解量大的，能產生更多的子代，有更多的噬菌體侵染未裂解的細菌。PH值為7的環境最適合噬菌體DNAⅢ生存，因此DNAⅢ能在人體血液(PH值7.35-7.45)內存活、殺菌。人巨噬細胞溶酶體和內吞體的pH值約為5[23]，在該PH值環境中DNAⅢ仍具有殺菌能力，說明胞內菌有可能被DNAⅢ裂解。噬菌體DNAⅢ對于23株耐藥MTB臨床分離株，寬噬率高達78.26%。而且DNAⅢ還能裂解MDR-TB和XDR-TB株。因此DNAⅢ治療耐藥結核臨床運用前景良好。

吸附宿主菌是噬菌體感染宿主的第一步，抗血清可抑制吸附過程。K值越高抗原性越強[7]，DNAⅢ的K值為770.01，比D29的K值(1069.50)低，說明與D29相比機體更不容易清除DNAⅢ。噬菌體DNAⅢ的抗血清交叉中和實驗說明DNAⅢ與其余8株噬菌體之間無交叉吸附表位。

4 結論

DNAⅢ潛伏期較短，裂解譜廣，抗原性低，能直接殺滅耐藥MTB，存在殺滅休眠菌及胞內菌可能，具有抗耐藥結核潛力。噬菌體DNAⅢ可作為治療耐藥結核的噬菌體雞尾酒療法的配方噬菌體。