乳酸菌和酵母菌發酵黃漿水制備有機酸工藝優化

喬明武，何人可，宋蓮軍，趙秋艷，龐曉晗

（河南農業大學食品科學技術學院，鄭州市大豆深加工重點實驗室，河南鄭州 450002）

黃漿水作為傳統豆制品生產排放的乳清廢水，具有豐富的營養價值。黃漿水中富含蛋白質、大豆低聚糖、大豆異黃酮和大豆皂苷、一定量的B族維生素、有機酸、水溶性蛋白、氨基酸、脂類等營養成分，以及K，P，Ca，Fe等微量元素[1-6]。目前，大量的黃漿水主要作為工業廢棄物被排放，所含豐富的營養素未被利用，其化學耗氧量（COD）、生物耗氧量（BOD） 值較高，總氮（TN） 和氨氮（NH3-N）也較高，屬于高濃度廢水，因此也極易腐敗，嚴重污染環境。據報道，生產75 t豆制品所排放的廢水，相當于2.5～3.0萬人的城市一天的生活污水[2，5]。我國豆腐制品加工量較大，黃漿水的處理排放也給企業帶來沉重的負擔。因此，將黃漿水作為新的種質資源綜合利用意義重大。

試驗以黃漿水為主要培養基，以乳酸菌和酵母菌為發酵劑，通過對發酵產物的總酸度、pH值、氨基酸態氮和檸檬酸、醋酸、酒石酸、丁二酸、乳酸5種有機酸含量變化分析，確定最佳發酵工藝，以提高產酸量，為黃漿水富集產酸工業提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃豆，市售；內酯，由江西新黃海醫藥食品化工有限公司提供；消泡劑，由鄭州市二七大河精細化工廠提供；乳酸菌、酵母菌，由微生物實驗室保存。

1.2 儀器與設備

P680ALPG-4型高效液相色譜儀，戴安中國有限公司產品；TDL-5-A型臺式離心機，上海安亭科學儀器廠產品；SHZ-D型循環水式多用真空泵，河南智誠科技發展有限公司產品；BS-1EA型數顯振蕩培養箱、HY-5型回旋式振蕩器，金壇市杰瑞爾電器有限公司產品；YXQG01型蒸汽消毒器，山東新華醫療器械廠產品；BCM-1000A型雙人超凈工作臺，蘇州安泰技術有限公司產品；FA2004A型電子天平，上海精天電子儀器有限公司產品；PHS-3CPH型測定儀，上海理達儀器廠產品；UV-2000型紫外可見分光光度計，尤尼柯儀器有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃漿水的預處理

取一定量的黃漿水，以轉速5000 r/min離心15min，取上清液。利用離子交換去除上清液黃漿水中的陽離子，每1 L黃漿水料液在3～4 min內勻速通過離子交換樹脂，通過次數為10～15次。最后加入5%的活性炭，在120 W功率下超聲50 min后，真空抽濾法去除活性炭，得黃漿水處理液備用。

1.3.2 發酵培養

取100 mL黃漿水處理液置于三角瓶中，添加2%葡萄糖，于121℃條件下滅菌15 min，冷卻至室溫后，從斜面接一環乳酸菌、酵母菌到100 mL黃漿水液體培養基中，于38℃條件下培養24 h，進行活化并擴大培養后備用。

取一定量添加2%葡萄糖的黃漿水培養基，按不同比例接種乳酸菌和酵母菌，在38℃條件下發酵72 h，分析發酵產物，確定最佳發酵工藝。

1.3.3 發酵產物含量測定

（1） 產酸總量的測定。采用GB 5009.239—2016食品安全國家標準食品酸度的測定的方法測定總酸。

（2） 氨基酸態氮測定。采用GB 5009.235—2016食品安全國家標準食品中氨基酸態氮的測定的方法測定氨基酸態氮含量。

（3）黃漿水中有機酸含量測定。參考GB5009.157—2016食品安全國家標準食品有機酸的測定和李健等人[3]HPLC法進行有機酸的測定。色譜條件：Agilent Eclipse XDB-C18型色譜柱 （4.6 mm×150 mm，5 μm）；檢測器為紫外檢測器，檢測波長210 nm；流動相為甲醇、0.01 mol/L KH2PO4－H3PO4緩沖溶液（3∶97，pH值2.85）；流速0.8 mL/min，柱溫25℃，進樣量20 μL。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌和酵母菌分別發酵產物含量對比結果

乳酸菌、酵母菌分別發酵黃漿水培養基時，對發酵產物總酸度、pH值、氨基態氮含量、有機酸含量進行對比。

乳酸菌和酵母菌發酵產物對比見表1。

表1 乳酸菌和酵母菌發酵產物對比

由表1可知，經乳酸菌、酵母菌發酵后的產物，有機酸含量均有顯著性提高。乳酸菌發酵后產物與未發酵組相比，總酸度、氨基酸態氮、檸檬酸、醋酸、酒石酸、丁二酸和乳酸含量極顯著性增加（p＜0.01），pH值顯著性減小（p＜0.05）；酵母菌發酵后產物與未發酵組相比，氨基酸態氮、檸檬酸、醋酸、酒石酸和丁二酸含量極顯著性增加（p＜0.01），總酸度和乳酸含量顯著性增加（p＜0.05），pH值極顯著性減小（p＜0.01）。乳酸發酵后，產物總酸度、氨基酸態氮、檸檬酸、酒石酸和乳酸含量大幅增加，且效果優于酵母菌發酵；酵母菌發酵后，產物醋酸含量大幅增加且效果優于乳酸發酵。

2.2 乳酸菌與酵母菌混合發酵產物含量結果2.2.1 總酸度和pH值變化結果

不同接種比例的乳酸菌和酵母菌混合發酵黃漿水培養基時，發酵產物總酸度和pH值的變化不同。

乳酸菌與酵母菌接種比對發酵產物總酸度的影響見圖1，乳酸菌與酵母菌接種比對發酵產物pH值的影響見圖2。

圖1 乳酸菌與酵母菌接種比對發酵產物總酸度的影響

由圖1可知，當乳酸菌與酵母菌接種比為1∶1時，酸度顯著性最低（p＜0.05） 為5.5 g/L；當乳酸菌與酵母菌接種比為4∶1時，酸度顯著性最高（p＜0.05） 為9.8 g/L，但低于單一乳酸菌發酵時的酸度11.0 g/L。

圖2 乳酸菌與酵母菌接種比對發酵產物pH值的影響

由圖2可知，當乳酸菌與酵母菌接種比為1∶1時，pH值最高為4.43；乳酸菌與酵母菌接種比為4∶1時，pH值最低為3.96，但大于乳酸菌發酵時的3.52，由此可知當乳酸菌發酵時pH值最高。

2.2.2 氨基態氮變化結果

不同接種比例的乳酸菌和酵母菌混合發酵黃漿水培養基時，對發酵物氨基態氮含量的變化情況進行研究。

乳酸菌與酵母菌接種比對發酵物氨基態氮含量的影響見圖3。

圖3 乳酸菌與酵母菌接種比對發酵物氨基態氮含量的影響

由圖3可以看出，隨著乳酸菌與酵母菌接種比的變化，乳酸菌接種量逐步增加，酵母菌接種量逐步減少，氨基態氮含量呈現基本遞增的趨勢，氨基態氮含量在乳酸菌與酵母菌接種比為4∶1時含量最高為0.39 g/L，但仍低于乳酸菌發酵時的氨基態氮含量0.41 g/L，說明氨基態氮最佳發酵方式為乳酸菌發酵，乳酸菌發酵可以有效增加蛋白質和氨基酸的含量，提高黃漿水的營養價值，尤其在生產γ-氨基丁酸方面前景廣闊[5]。

2.2.3 有機酸變化結果

不同接種比例的乳酸菌和酵母菌混合發酵黃漿水培養基時，對發酵產物檸檬酸、醋酸、酒石酸、丁二酸、乳酸含量的情況進行研究。

乳酸菌與酵母菌接種比對有機酸含量的影響見圖4。

由圖4可以看出，發酵液中乳酸含量隨著乳酸菌與酵母菌接種比的變化呈現遞增趨勢，在乳酸菌與酵母菌接種比為1∶1時，含量最低為0.991 5 g/L；乳酸菌與酵母菌接種比為4∶1時，含量為1.108 3 g/L，顯著高于其他試驗組（p＜0.05），但仍低于乳酸菌發酵時的檸檬酸含量1.207 2 g/L。

圖4 乳酸菌與酵母菌接種比對有機酸含量的影響

醋酸含量隨著乳酸菌與酵母菌接種比的變化呈遞減趨勢，在乳酸菌與酵母菌接種比為4∶1時，含量最低為0.685 7 g/L；乳酸菌與酵母菌接種比為1∶4時，含量最高為0.985 9 g/L，但仍低于酵母菌發酵時的檸檬酸含量1.074 6 g/L。

酒石酸含量隨著乳酸菌與酵母菌接種比的變化含量呈遞減趨勢，在乳酸菌與酵母菌接種比為4∶1時，含量最低為2.170 1 g/L；乳酸菌與酵母菌接種比為1∶4時，含量最高為2.385 9 g/L。

丁二酸在發酵液中含量很低，且乳酸菌與酵母菌接種比對丁二酸含量的影響不大，在乳酸菌與酵母菌接種比為3∶2時，發酵液中丁二酸含量最高為0.074 0 g/L。

乳酸在發酵液中含量很低，但在乳酸菌、酵母菌接種比為2∶3和4∶1時，乳酸含量有明顯提升；當乳酸菌與酵母菌接種比為4∶1時，含量最高為0.404 9 g/L，但仍低于乳酸菌發酵時的含量1.043 9 g/L，所以當乳酸菌發酵時乳酸含量最高為1.043 9 g/L，乳酸菌最佳發酵方式為乳酸菌發酵。采用聯苯比色法對發酵液中乳酸含量進行單獨測定，經過多次試驗發現，發酵液中乳酸的含量為不可測出。說明乳酸在發酵液中的含量極低，可能是因為乳酸菌產生的乳酸迅速發生了轉化，這與圖4的液相結果相符合。

3 結論

黃漿水經乳酸菌、酵母菌發酵后的產物，有機酸含量均有顯著性增加。乳酸菌發酵黃漿水時，產物中檸檬酸、酒石酸、乳酸含量大幅增加；酵母菌發酵黃漿水時，產物中醋酸含量大幅增加。乳酸菌和酵母菌聯合發酵促進了產物有機酸含量的增加，為黃漿水工業化生產不同有機酸提供理論依據。因此，生產乳酸的最佳發酵方式為乳酸菌發酵，生產醋酸的最佳發酵方式為酵母菌發酵，生產酒石酸的最佳發酵方式為乳酸菌與酵母菌以接種比1∶4發酵，生產丁二酸最佳發酵方式為乳酸菌與酵母菌以接種比3∶2發酵。