利拉魯肽對大鼠心肌微血管內皮細胞缺氧復氧損傷的影響

李丹丹，張 穎，陳韻岱

冠心病心肌梗死已經成為嚴重危害人類健康的頭號殺手，直接PCI術是目前心血管內科推薦的最為重要的有效治療手段[1]。但是，在臨床實踐中發現，在解除機械性梗阻恢復血流供應后，其末端血流供應的心肌組織并沒有完全有效的血流灌注，即出現無復流現象(no reflow)[2, 3]。無復流的發生減少了血運重建帶給患者心功能恢復的益處，使得住院死亡和再發心肌梗死的概率增加4～10倍，是影響患者即刻和長期預后的重要因素[4-8]。無復流是指在開通梗死相關動脈時，微循環血流阻力增大而導致的微循環灌注不良的現象[3]。再灌注時期大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成被認為是細胞發生IR損傷的重要啟動因素[9-11]。內皮細胞，尤其是冠脈末梢的心肌微血管內皮細胞(cardiac microvascular endothelial cells，CMEC)，作為血液和組織之間最重要的屏障，在缺血再灌注損傷中是最先被累及的，是組織缺血再灌注后產生ROS的重要來源。內皮細胞中ROS的生成有多種來源，其主要的來源是NADPH氧化酶、黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)、線粒體呼吸鏈、單核巨噬細胞來源等[12]。在多項研究中發現，XO在肝臟內皮細胞、肺動脈內皮細胞以及CMEC中有較高的表達量[13]。并且，XO介導氧化應激損傷以及細胞凋亡在再灌注損傷中可能發揮重要作用[14]。胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一種由腸道內分泌細胞分泌的腸促胰島素[15-17]。近年的基礎研究發現，Liraglutide除降糖作用以外，還具心血管保護作用，可減少心臟血管炎性反應、心肌缺血再灌注損傷、減少心肌梗死面積、抑制心肌細胞凋亡等[18-20]。本研究通過提取并體外培養SD乳鼠的CMEC，在H/R模型條件下，模擬細胞氧化應激損傷過程，予以Liraglutide預處理12 h對CMEC進行干預，探究藥物的保護作用和機制。

1 材料與方法

1.1 材料 主要藥品與試劑 Liraglutide、MTT試劑、Hoechst 33342染料購買于美國, Sigma公司； DCFHDA-ROS探針、DHE-ROS探針、丙二醛脂質過氧化物檢測試劑盒、GSH檢測試劑盒、超氧化物歧化酶檢測試劑盒均購于北京碧云天公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒(BD Biosciences, 美國)；caspase-3(1∶1000, Cell Signaling Technology), Bcl2 (1∶2000, Abcam), Bax (1∶2000, Abcam), and XO (1∶1000, Abcam)； CD31抗體(Bioss Inc. 中國)；GLP-1R抗體(Bioss Inc. 中國)。5～6 d、質量為12～16 g的SD乳鼠(雌雄不限)，購自解放軍總醫院動物室，該研究中動物、細胞來源，符合國家《實驗動物管理條例》及解放軍總醫院倫理準則。

1.2 方法

1.2.1 CMEC的提取和培養 參照Nishida等[21]雙酶消化分離原代細胞，并在此基礎上進行了改良。簡述如下：5只乳鼠處死后取出左心室， 75%乙醇中浸泡15 s，PBS清洗3遍后剪碎組織塊，0.2%Ⅰ型膠原酶37 ℃水浴持續震蕩攪拌消化10 min，觀察待組織塊明顯變小后，加入0.25%胰蛋白酶37 ℃水浴繼續消化3 min，隨即終止消化，200目濾網濾過消化后的液體，1000 r/min,7 min離心分離細胞和多余的培養液，離心完成后棄掉上清液，以1×105/ml的密度緩慢吹打細胞后， 37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養細胞4 h，去除懸浮未貼壁的細胞，繼續培養24 h后第一次換液，待細胞至80%融合生長后，0.25%胰蛋白酶消化傳代。根據實驗需要使用第一或第二代細胞。CD31抗體進行免疫細胞化學染色鑒定CMEC純度。缺氧4 h加復氧4 h，誘導CMEC凋亡模型。

1.2.2 流式細胞術檢測 模型建立成功后，細胞誘導完成時，胰蛋白酶消化收集細胞，隨后吹打重懸至200 μl的Annexin V-FITC緩沖液中，再加入5 μl的Annexin V-FITC溶液進行37 ℃孵育(避光條件下30 min)，最后再加入10 μl 的PI與上述液體共同避光條件下孵育5 min，結束后立即對細胞進行流式細胞學定量分析。

1.2.3 ROS檢測 ROS探針作為檢測細胞內ROS的方法，細胞模型建立完成后，更換為正常培養液，將10 μM的DHE加入培養體系中，隨后在37 ℃黑暗中處理30 min，DAPI染核3 min，隨后進行常規PBS洗滌共3次，后用共聚焦顯微鏡觀察胞內ROS含量變化。在進行ROS定量檢測時，使用流式細胞學方法檢測。

1.2.4 MDA、GSH、SOD、GPx檢測 酶標儀分析GSH、SOD、MDA、GPx的含量變化，按試劑盒說明書操作。首先將處理的細胞收集后進行離心沉淀，破膜后收集細胞蛋白進行ELISA檢測。預先繪制標準蛋白含量曲線，然后按照說明書進行ELISA雙夾心法檢測，根據酶標儀測定的吸光值計算最終的蛋白含量及蛋白活性。

1.2.5 免疫熒光染色 細胞處理完成后，棄掉培養液并使用PBS清洗3遍，4%冰甲醛常溫固定10 min，0.5% Triton X-100通透細胞膜5 min，山羊血清10%室溫封閉細胞特異性抗原1 h， 一抗孵育(1∶250) 4 ℃過夜。PBS漂洗3次后加二抗(1∶2000)，室溫避光孵育2 h。滴加DAPI，孵育5 min，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.6 干擾RNAi 本實驗中針對XO蛋白進行抑制表達實驗。siRNA的設計由上海吉瑪公司完成，序列如下：siRNA: 5′-CCACCUCCAAGAUUCAUAUTT-3; Anti-sense: 5-CCGAGAAUGAGCCUGAUUU-3, 陰性對照組的序列如下：siRNActrl: 5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3; Anti-sense:5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3。

1.2.7 Western blot檢測 各組處理結束后，提取總蛋白。10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，PVDF膜濕轉后山羊血清室溫封閉1 h，加入相應一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜后使用HRP 標記的相應二抗(1∶3000)室溫反應60 min，暗室曝光，以β-actin作為內參。采用Quantity One軟件采集信號和灰度掃描。實驗重復3次。

2 結 果

2.1 原代CMEC的培養與鑒定 培養的CMECs呈梭形，形似鵝卵石，貼壁培養24 h后開始生長(圖1A)，72～96 h細胞長滿瓶底，呈典型CMEC的鋪路石樣結構(圖1B)。使用免疫熒光技術對CMECs表面標記分子CD31(圖1C)與Ⅷ(圖1D)因子進行鑒定,提示分離的CMEC沒有被心肌細胞和成纖維細胞污染，純度較高，可以供下一步實驗使用。

圖1 原代CMEC的培養與鑒定

A-B.CMEC接種后24 h和72 h的細胞形態學觀察;C-D. CMEC表面標記物CD31和VIII因子的免疫熒光鑒定

2.2 CMEC上GLP-1R的表達情況 于倒置熒光顯微鏡下觀察， CD31單克隆抗體與GLP-1R多克隆抗體進行共定位染色，細胞內分別呈綠色和紅色熒光，融合后提示雙陽性率>95%(圖2)。

2.3 不同濃度Liraglutide對細胞增殖能力的影響 同一時間點上OD值隨Liraglutide藥物濃度增加而顯著升高，于100 nM組達到最高促生長濃度(P<0.05)。不同時間點上，總體趨勢提示細胞于藥物干預24 h后出現對數生長期，于84 h后進入生長平臺期(圖3)。12 h細胞密度無明顯的統計學差異，因此將藥物預處理12 h作為后續實驗的干預條件。

圖2 CMEC上GLP-1R的表達情況

A.CD31單克隆抗體定位染色;B.GLP-1R多克隆抗體定位染色;C.融合后

圖3 不同濃度Liraglutide對細胞增殖能力的影響

2.4 Liraglutide降低H/R模型下的CMEC凋亡 與正常對照組細胞相比，H/R模型導致早期凋亡細胞(Annexin V+/PI-)數量顯著提高至20.66%±1.30%(P<0.05)(圖4A)。而Liraglutide可以顯著降低早期細胞凋亡的數量，并且呈現濃度依賴性(Liraglutide 1 nM 17.38%±0.82%; 10 nM 12.49%±1.02%; 100 nM 8.36% ±1.19%;P<0.05vsH/R)。同時發現100 nM Liraglutide對于細胞的保護作用是最強的，因此后續實驗選用100 nM預處理12 h作為干預條件。同時，H/R組細胞內的ROS顯著上升，而Liraglutide干預后可以顯著降低胞漿內ROS含量(圖4B)。缺氧后給予H2O2可以顯著提高胞漿內的ROS，同時伴隨著凋亡蛋白caspase3、Bax等蛋白的顯著增加；而使用ROS清除劑NAC作為陰性對照，一方面中和了過度的ROS，另一方面也顯著降低了凋亡蛋白的含量(圖5)。此外，在H/R模型下，SOD、GSH和GPx的含量顯著下降而MDA在胞漿內大量聚集，而Liraglutide干預后可以顯著上升上述抗氧化因子SOD、GSH和GPx，同時表現為下降的MDA含量(圖6)。

圖4 Liraglutide對H/R模型下的CMEC凋亡率的影響

圖5 Western Blot檢測各組間凋亡蛋白和保護性蛋白表達的差異

圖6 H/R模型以及Liraglutide預處理對細胞MDA、GPX、SOD、GSH含量的影響

2.5 Liraglutide通過抑制XO-ROS，最終減少線粒體凋亡通路激活 在H/R模型條件下，XO的含量mRNA和蛋白水平均有顯著升高(圖7A-B)。使用siRNA敲低XO，可以顯著減少H/R模型下ROS的產生(圖7C-D)。同時，過度的XO生成會伴隨著caspase3表達的明顯提高，敲低XO則會顯著減少caspase3的生成。使用Liraglutide預處理，XO的mRNA水平和蛋白水平均有顯著降低。同時，敲低XO可以進一步降低胞漿內caspase3的表達(圖8)。

圖7 Liraglutide對XO-ROS的影響

A-B. PCR和Western Blot檢測各組間XO表達量的不同；C-D. 流式細胞學定量檢測各組間DCFHDA標記的胞漿ROS平均熒光強度的不同

3 討 論

微血管是終末循環末梢，在很大程度上決定組織灌注水平和氧供平衡。缺血后的再灌注時期產生了大量的活性氧ROS，進而誘導細胞內過度的氧化應激水平，損傷細胞內蛋白質、內質網、線粒體等亞細胞結構的功能，從而導致了細胞的功能障礙以及隨后的細胞程序性死亡過程[22]。而值得注意的是，在心臟的組織細胞中，心肌微循環內皮細胞是最易受到攻擊的，由于其在第一時間收到缺氧損傷的刺激，并且在第一時間恢復了血流[10]，因此微循環內皮細胞比心肌細胞和其他組織結構更早發生再灌注損傷，出現臨床上常見的介入治療后再灌注并發癥-無復流。由于微循環的破壞，使得組織最終的能量和氧供得不到很好的補充，因此進一步加重心肌梗死面積的擴展以及隨后的心功能降低，造成心肌梗死圍術期的病死率顯著提高[23]。由此保護介入術后再灌注時期的微循環的穩定，將會顯著提高PCI治療的效果，并增加心肌梗死患者圍術期的臨床獲益。

目前研究發現，再灌注時期，復氧期將會產生大量的ROS，誘導細胞內過度的氧化應激，損傷細胞的功能，造成微血管內皮細胞的凋亡。細胞內ROS的來源多種多樣：線粒體呼吸鏈[24]、NAD(P)H[25]、XO[26]以及一些蛋白底物代謝過程中產生的負離子電荷。由于內皮細胞中線粒體的缺乏，因此線粒體介導的ROS產生并不會很大程度上影響細胞的功能[27]。另一方面值得關注的是，XO途徑介導的ROS爆發可能是內皮細胞氧化應激損傷中被忽略的一部分。筆者團隊的前期研究提示，CMEC中H/R條件下XO表達和轉錄明顯增加[28]， 有研究認為XO是微血管內皮中ROS大量產生的主要因素之一[29]。XDH作為XO的前體形式在細胞內是持續表達的，在H/R條件下，大量XDH轉變為XO[30]，生成過量ROS。其具體的機制為：缺氧條件下，細胞內的ATP由于大量消耗被分解為ADP、AMP并最后代謝成為次黃嘌呤。一旦進入再灌注時期，在氧的介導下，XO大量代謝次黃嘌呤生成尿酸的過程中將會生成大量的氧負離子[31]，由此造成細胞內ROS含量的顯著升高。因此在我們的實驗中，建立了H/R模型來模擬缺血再灌注損傷。在模型中，復氧期將會顯著提高CMEC中的XO的含量，從而誘導ROS的爆發。由此說明H/R激活的XO是細胞內ROS含量的重要決定因素，干預XO的蛋白水平以及轉錄活性，將會顯著降低細胞內過度的活性氧，從而抑制氧化應激介導的細胞凋亡。但是XO-ROS是如何誘導細胞凋亡的，目前研究甚少。

圖8 Confocol觀察不同組間XO和Caspase3熒光共定位染色

正常情況下，機體內ROS生成和清除系統處于動態平衡，由于多種原因導致的ROS生成增多或清除能力下降都會導致細胞的氧化應激損傷。細胞內過量ROS生成可導致細胞脂質過氧化水平增高、DNA氧化損傷、蛋白質過氧化以及通過多種途徑誘導細胞凋亡，例如：激活細胞NF-κB轉核，激活P53或SAPK通路誘導細胞，以及線粒體介導的細胞凋亡通路[25]。本實驗發現在H/R模型中，由XO來源的過量胞漿ROS，是誘導細胞凋亡的關鍵。進一步實驗發現，予以Liraglutide預處理或敲低XO，胞漿ROS生成明顯減少，同時可以在一定程度上降低caspase3表達量，最終保護CMEC在H/R條件下的結構和功能。本實驗證實了在H/R條件下，XO-ROS是最終線粒體呼吸鏈ROS爆發的重要上游激活因子，應當作為早期保護細胞氧化應激損傷的重要靶點進行更多的研究。

總之，Liraglutide可以通過恢復胞內正常的XO-ROS水平，從而降低H/R導致的CMEC氧化應激凋亡，促進細胞存活。