腎母細胞瘤組織中Par-4基因表達量檢測及其與腫瘤增殖、侵襲的關系研究

黃朝友，李 響，賴 飛 ，楊 振， 錢友良

1.成都市第二人民醫(yī)院泌尿外科(成都 610017)，2.四川大學華西醫(yī)院泌尿外科(成都610041)

主題詞 @腎母細胞瘤 @Par-4基因 基因表達

腎母細胞瘤是一種胚胎惡性腫瘤，又被稱為Wilms瘤，是目前兒童第二位常見的腹部惡性腫瘤，98%以上的病例發(fā)生于10歲以下，其中3歲以下兒童更為多見[1-2]。Par-4基因首先在前列腺癌細胞中被發(fā)現(xiàn)，目前在結(jié)直腸癌、肝癌等多種惡性有組織中呈異常表達，可能通過影響癌細胞增殖、侵襲的方式來參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3-4]。目前Par-4基因在腎母細胞瘤中扮演的角色未明，本次研究對比活檢正常組織、腎母細胞瘤組織中該基因表達量的差異，并進一步探討該基因表達與后續(xù)增殖、侵襲相關基因表達量的內(nèi)在聯(lián)系，以期明確Par-4基因?qū)δI母細胞瘤發(fā)生發(fā)展的影響，為后續(xù)臨床治療實踐提供參考。

資料與方法

1 一般資料 選取2014年1月到2017年1月間在本院確診腎母細胞瘤的患者60例作為研究對象，其中，男性32例，女性28例，年齡1～8歲，平均(3.72±0.96)歲。醫(yī)院倫理委員會批準此次研究實施。納入標準如下：①活檢組織經(jīng)病理確診為腎母細胞瘤/正常腎臟組織；②首次確診疾病、既往未接受相關治療；③家屬簽署知情同意書。排除標準：①合并嚴重先天性疾患；②合并嚴重全身感染性疾病；③合并其他組織臟器腫瘤性疾病。

2 Par-4基因表達量檢測 取腎臟病灶及瘤旁正常組織活檢標本，采用熒光定量PCR法檢測其中Par-4基因表達量，具體步驟如下：①細胞裂解；②4 ℃下12 000rpm離心，分離上層無色水相；③沉淀總RNA并清洗、干燥；④分析總RNA純度及濃度；⑤使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成樣品cDNA；⑥使用熒光定量PCR試劑盒合成目標基因。設置瘤旁組織中Par-4基因表達量為標準值100，計算腎母細胞瘤組織中該基因的對應表達量。

3 增殖、侵襲相關基因表達量檢測 同樣取腎臟病灶及瘤旁正常組織活檢標本，采用熒光定量PCR法檢測其中增殖相關基因：IGF-Ⅱ、IRS-2、TGF-β、PTEN；侵襲相關基因：Axin、Ki-67、E-cad的表達量，方法同2。

4 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件，Par-4基因表達量、增值及清洗相關基因表達量 采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 Par-4基因表達量 瘤旁組織中Par-4基因表達量為100，腎母細胞瘤組織中Par-4基因表達量為(62.18±7.05)。腎母細胞瘤組織中Par-4基因表達量顯著低于瘤旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2 增殖相關基因表達量 腎母細胞瘤組織中增殖相關基因IGF-Ⅱ、IRS-2、TGF-β mRNA的表達量高于瘤旁組織，PTEN mRNA的表達量低于瘤旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。

表1 不同組織中增殖相關基因表達量的比較

3 侵襲相關基因表達量 腎母細胞瘤組織中侵襲相關基因Axin、E-cad mRNA的表達量低于瘤旁組織，Ki-67 mRNA的表達量高于瘤旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。

表2 不同組織中侵襲相關基因表達量的比較

4 相關性分析 經(jīng)Pearson檢驗發(fā)現(xiàn)，腎母細胞瘤組織中Par-4基因表達量與增殖相關基因IGF-Ⅱ、IRS-2、TGF-β基因表達量呈負相關，與PTEN基因表達量呈正相關；與侵襲相關基因Axin、E-cad基因表達量呈正相關，與Ki-67基因表達量呈負相關(P<0.05),見表3。

表3 Par-4基因表達量與瘤細胞惡性生物學行為的相關性

討 論

腎母細胞瘤起源于未分化的后腎胚胎，在幼齡兒童中最為常見，其生長十分迅速、惡性程度高。腎母細胞瘤的治療缺乏特效手段及靶向藥物，探索調(diào)控癌細胞惡性生物學行為的“分子開關”，可能為遠期該病治療提供新思路。Par-4基因是在前列腺癌大鼠癌細胞中發(fā)現(xiàn)的一類具有促進腫瘤細胞凋亡的基因，其作用的實現(xiàn)包括:①直接誘導細胞凋亡；②增加癌細胞對外界凋亡信號敏感性兩方面[5-6]。Par-4基因在腎母細胞瘤中扮演的角色尚未有明確定論，本次研究取腎母細胞瘤患者的活檢組織，對比病灶組織、瘤旁組織中該基因表達量的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與瘤留旁組織比較，腎母細胞瘤組織中Par-4基因表達量較低，說明Par-4基因異常低表達參與腎母細胞瘤發(fā)生。

腫瘤細胞惡性增殖是該疾病最突出的生物學特征，探索腎母細胞瘤相關增殖分子表達情況，有助于闡明疾病發(fā)生機制。IGF-Ⅱ是結(jié)構(gòu)及功能上與胰島素類似的生長因子，已經(jīng)在國內(nèi)外研究中被證實可調(diào)節(jié)細胞有絲分裂，在正常細胞及癌變的腫瘤細胞中均發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，可促進腫瘤細胞增殖[7-8]。IRS-2可調(diào)控葡萄糖代謝，在細胞有絲分裂中也扮演重要角色，已經(jīng)在神經(jīng)母細胞瘤、乳腺癌、間皮細胞瘤中發(fā)現(xiàn)該分子介導的信號傳導通路可促進腫瘤細胞增殖轉(zhuǎn)移[9]。TGF-β通過與其特異性受體結(jié)合、激活下游分子Smad并發(fā)生磷酸化，可進入細胞核調(diào)節(jié)多種基因轉(zhuǎn)錄、促進腫瘤細胞增殖[10-11]。PTEN是近年新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，屬于PI3K/AKT信號通路的內(nèi)源性負性調(diào)控蛋白，經(jīng)阻斷PI3K/AKT信號通路實現(xiàn)抑癌作用[12-13]。文中對比不同組織中上述增殖相關基因表達量的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與瘤旁組織比較，腎母細胞瘤組織中IGF-Ⅱ、IRS-2、TGF-β的表達量較高，PTEN的表達量較低，這與腎母細胞瘤的無限增殖活性吻合。進一步經(jīng)Pearson檢驗發(fā)現(xiàn)，腎母細胞瘤組織中Par-4基因表達量與IGF-Ⅱ、IRS-2、TGF-β基因表達量呈負相關，與PTEN基因表達量呈正相關，證實Par-4基因可負調(diào)控腎母細胞瘤細胞的增殖活性。

腫瘤細胞的遠處轉(zhuǎn)移主要由侵襲相關基因介導，腎母細胞瘤中也存在較多侵襲相關基因的異常表達，檢測其具體表達量可間接判斷腫瘤惡性程度。Axin是一種腫瘤抑制因子，通過下調(diào)β-catneni水平而發(fā)揮抑癌作用，已經(jīng)在原發(fā)性肝癌及結(jié)腸癌細胞中發(fā)現(xiàn)其異常低表達[14-15]。Ki-67在靜止細胞中不表達，、特異性存在于增殖細胞中，已經(jīng)在膀胱癌、胃癌、大腸癌中發(fā)現(xiàn)該基因過量表達，且其表達量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、治療預后密切相關[16]。E-cad是調(diào)節(jié)細胞間、細胞與基質(zhì)之間粘附反應的重要媒介，在維持組織結(jié)構(gòu)形態(tài)方面發(fā)揮重要作用，其表達量與腫瘤細胞的分化狀態(tài)及腫瘤轉(zhuǎn)移潛能直接相關。E-cad基因表達量降低，可能是腫瘤細胞惡性程度高、侵襲擴散能力強的重要標志。本次研究對比不同活檢組織中上述侵襲相關基因表達量的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與瘤旁組織比較，腎母細胞瘤組織中Axin、E-cad基因表達量較低，Ki-67基因表達量較高，說明促侵襲基因的高表達、抗侵襲基因的低表達共同參與腎母細胞瘤細胞的惡性行為。進一步經(jīng)相關性分析，發(fā)現(xiàn)：腎母細胞瘤組織中Par-4基因基因表達量與Axin、E-cad基因表達量呈正相關，與Ki-67基因表達量呈負相關，證實Par-4基因可負調(diào)控腎母細胞瘤細胞的侵襲活性。

綜合上文所述，腎母細胞瘤組織中Par-4基因表達量異常下降，對腫瘤細胞的增殖及侵襲活性發(fā)揮負調(diào)控作用，有望成為遠期該疾病基因治療的新靶點，有待后續(xù)研究進一步深入探討。