藥物淋巴細胞刺激試驗診斷抗結核藥物所致超敏反應的臨床價值研究

吳于青，代亮，陳雪花，廖永美

中國最新潛伏感染調查顯示，至少有2億～3億人感染了結核分枝桿菌，我國現有500萬肺結核患者，按照5%～15%的結核病發病風險進行估算，我國將可能產生4 000萬新的活動性結核病患者［1］。終止結核病流行，及時診斷治愈每一例結核病患者尤為重要。

超敏反應是結核病患者在治療過程中常見的不良反應之一，約占抗結核藥物不良反應的15%［2］；按Gell-Coombs分類方法，超敏反應分為速發型（Ⅰ型）、細胞毒型（Ⅱ型）、免疫復合物型（Ⅲ型）、遲發型（Ⅳ型）超敏反應，而抗結核藥物所致超敏反應主要表現為遲發型（Ⅳ型）超敏反應［3］。藥物斑貼試驗因靈敏度、特異度均較低臨床已較少采用，目前臨床診斷抗結核藥物所致超敏反應主要依靠藥物激發試驗（DPT），然而由于抗結核藥物常是聯合應用，其可再次引發超敏反應甚至剝脫性皮炎，不僅延長患者的住院時間，同時增加患者的痛苦，一定程度上打擊其治療疾病的信心，極不利于我國結核病的防控。因此，如何快速、安全、準確地找出致敏藥物是臨床醫師亟需解決的難題。本研究旨在探究藥物淋巴細胞刺激試驗（DLST）診斷抗結核藥物所致超敏反應的靈敏度、特異度，為今后全面開展抗結核藥物所致超敏反應的體外檢測方法奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 研究標準

1.1.1 納入標準 （1）符合2013年中華醫學會結核病學分會《肺結核診斷和治療指南》［4］中初治肺結核的相關診斷標準。（2）臨床表現及實驗室檢查符合2010年《臨床皮膚病學》［5］中藥物所致超敏反應的診斷，并由2名專科醫師共同診斷為藥物所致超敏反應。

1.1.2 排除標準 （1）合并HIV感染者；（2）合并慢性腎臟病、糖尿病、造血系統疾病及自身免疫性相關疾病者；（3）接受抗結核治療的同時在服用其他疾病治療藥物。

1.1.3 剔除標準 已納入患者符合下列選項之一者予以剔除：（1）誤診、誤納；（2）抗過敏治療過程中使用了免疫抑制劑。

1.2 一般資料 選取2015年1月—2016年12月在江西省胸科醫院住院的初治肺結核治療過程中發生超敏反應的患者60例，年齡21～62歲，平均年齡（40.8±7.0）歲。同期選取本院初治肺結核治療過程中未發生超敏反應的患者60例作為對照組，年齡19～65歲，平均年齡（41.0±7.3）歲。兩組患者性別（χ2=0.917）、年齡（t=1.532）比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究經江西省胸科醫院倫理委員會審核批準，患者均知情同意。

1.3 方法

1.3.1 實驗藥物的制備 取患者已服用的可疑抗結核藥物〔異煙肼（INH）、乙胺丁醇（EMB）、利福平（RFP）、吡嗪酰胺（PZA）〕的單次劑量，用5 ml雙蒸水或二甲基亞砜（DMSO）劇烈震蕩溶解，再用0.22 μm濾器過濾除菌，予RPMI-1640培養液稀釋成3個濃度梯度（1∶10、1∶100、1∶1 000）。

1.3.2 外周血單核細胞（PBMC）分離 患者入組后在規定時間內留取10 ml靜脈血備檢，采用密度梯度離心法從患者肝素抗凝的血標本中分離PBMC，1×磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后，重懸于2 ml RPMI-1640培養液（含10%胎牛血清+青鏈霉素）并計數，調整細胞濃度為1×106/ml。在96孔板每孔加入1×105/100 μl PBMC，再加入預先制備的刺激藥物5 μl。分別設置陰性對照孔（相同濃度的藥物溶解介質+培養液+PBMC）、陽性對照孔〔植物血凝素（PHA）5 μg/ml+培養液+PBMC〕和調零孔（僅為培養液），每組設3個復孔。同時，每次實驗時均隨機取1例對照組患者的抗凝血標本進行相同的實驗。將培養板置于37 ℃、5% CO2培養箱培養60 h，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態。

1.3.3 DLST 培養60 h后，向每孔加入10 μl Cell Counting Kit-8（CCK-8）溶液，繼續培養12 h后，用酶標儀測定各孔在450 nm處的光密度（OD），計算刺激指數（SI），SI=（刺激OD-調零孔OD）/（陰性對照孔OD-調零孔OD），SI≥1.80為陽性。對每種藥物分別進行DLST，任意一種藥物檢測結果為陽性者，判定該患者為DLST陽性。如果陽性對照孔的SI＜1.80，或者3個復孔的偏差過大，則判定該藥物的DLST結果不可靠，需重新檢測。

1.3.4 導致超敏反應藥物的判定 患者停藥后超敏反應癥狀緩解并確定DLST結果后，進行DPT（臨床判斷何種藥物所致超敏反應的金標準［6］），每種藥物間隔時間3～4 d，試藥期間一旦出現DPT陽性［6］，即可確定為該藥物的超敏反應。

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析。計量資料以（x ±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DPT陽性和DPT陰性患者4種抗結核藥物的SI比較 DPT陽性患者INH、EMB、RFP和PZA的SI均高于DPT陰性患者，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

表1 DPT陽性和DPT陰性患者4種抗結核藥物的SI比較（x±s）Table 1 Comparison of the SI of the four anti-tuberculosis drugs in DPT-positive and DPT-negative patients

2.2 DLST對抗結核藥物所致超敏反應的診斷價值DPT共檢出66例次抗結核藥物所致超敏反應（其中4例次為EMB和RFP所致超敏反應，2例次為INH和EMB所致超敏反應）。DLST共檢出4例次兩種抗結核藥物所致超敏反應（3例次為EMB和RFP所致超敏反應，1例次為INH和EMB所致超敏反應）。

DLST診斷INH、EMB、RFP、PZA所致超敏反應的靈敏度分別為52.38%、50.00%、43.48%、58.33%，特異度分別為97.98%、99.09%、97.94%、100.00%（見表 2～5）。

表2 DLST對INH所致超敏反應的診斷價值（例）Table 2 Diagnostic value of the DLST for INH-induced hypersensitivity

表3 DLST對EMB所致超敏反應的診斷價值（例）Table 3 Diagnostic value of the DLST for EMB-induced hypersensitivity

表4 DLST對RFP所致超敏反應的診斷價值（例）Table 4 Diagnostic value of the DLST for RFP-induced hypersensitivity

表5 DLST對PZA所致超敏反應的診斷價值（例）Table 5 Diagnostic value of the DLST for PZA-induced hypersensitivity

3 討論

抗結核治療過程中的藥物不良反應是影響患者治療進程和效果的關鍵因素。我國抗結核藥物不良反應的發生率平均為15%，表現為肝功能異常、超敏反應、關節痛等［7-9］；其中超敏反應是抗結核治療中最常見的不良反應之一。

目前臨床上對于超敏反應的處理方法是暫時中斷用藥，待患者超敏反應消失后采取DPT找出導致超敏反應的抗結核藥物，這樣不僅延長患者的住院時間，同時加重患者的痛苦，打擊患者治療疾病的信心，甚至導致患者放棄治療，極不利于我國結核病的防控。因此，尋求一種能快速、準確、安全地找出導致超敏反應的抗結核藥物的檢測方法，是結核病臨床工作人員共同的努力方向。

遲發型（Ⅳ型）超敏反應通常是在攝入抗結核藥物后數小時、數天甚至數周后發生，主要是由T淋巴細胞介導的免疫反應導致，由多種細胞因子參與。T淋巴細胞的活化在藥物刺激后幾分鐘內開始，引發鈣離子內流和轉錄因子表達增加。幾小時后，細胞因子如白介素（IL）-2、IL-3、IL-4、干擾素（IFN）-γ、轉化生長因子（TGF）-β和早期細胞活化標志受體如CD40L、CD69、CD25、CD71大量表達。T淋巴細胞活化后3～5 d，細胞進入功能分化期，分化為不同類型的T淋巴細胞（Th1、Th2、Th17）和產生不同類型的細胞因子（Th1、Th2、Th17型細胞因子），后者繼而又進一步影響T淋巴細胞功能。體外實驗就是基于以上活化過程，從膜表面標志受體表達上調、細胞因子產生增加、T淋巴細胞增殖到細胞毒性檢測等，在不同階段檢測不同活化指標［10-14］。

本研究采用CCK-8溶液檢測可疑藥物刺激后T淋巴細胞增殖，取代既往研究者采用的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）滲入法［15］，操作簡便、對實驗室要求低、結果變異率小，且為水溶性，實驗過程中不需要換液，尤其適合于懸浮細胞，且檢測的OD與活細胞數線性相關［15］，目前該技術已成熟，且已設立明確的陽性標準。

本研究對DLST檢測4種一線抗結核藥物（INH、EMB、RFP、PZA）所致超敏反應的診斷價值進行了分析，結果發現，DLST在診斷何種抗結核藥物所致超敏反應中具有一定意義，主要表現為高特異度（均在97.00%以上），且靈敏度較3H-TdR滲入法高［16］，但總體來說靈敏度還是偏低（＜60.00%），考慮可能原因為：（1）藥物所致超敏反應的病理機制是復雜的，T淋巴細胞免疫并不能完全涵蓋各種藥物所致超敏反應的原因；（2）本研究入組患者入院后在皮疹發生后的短時間內即留取靜脈血，考慮存在藥物洗脫期的影響。今后將在患者發生超敏反應后的不同時期內聯合多種體外檢測方法進行檢測，預計將提高靈敏度。

綜上所述，DLST在診斷患者因何種抗結核藥物所致超敏反應時具有較高的特異度，雖然靈敏度稍低，但對指導臨床用藥仍意義重大。