Wistar大鼠腎結石形成過程的動態觀察研究

錢成，王勤章，褚浩，徐浩，郝志強，錢彪

泌尿系結石是泌尿外科最常見的疾病之一，發病率高達5%～15%［1］，多發于腎臟，最常見結石類型為草酸鈣結石［2］。腎結石患者術后復發率較高且結石的形成原因難以明確，因此，研究結石形成機制是治療腎結石的重要突破點。研究結石形成機制的基礎在于腎結石動物疾病模型的建立，建模不但可以深入了解結石的形成過程和機制及結石成因的代謝問題，而且還可以幫助篩選抗結石的中西藥物。因此，設計和建立與人類腎結石類似的動物模型，對于探討腎結石的發病機制、預防和延緩結石形成、尋找防治腎結石的藥物等方面均有重要的意義。目前研究大多以乙二醇（EG）法建立大鼠腎結石模型后一次性處死取石［3］，而動態觀察腎結石形成過程的研究相對較少。因此，本文采用EG加氯化銨誘石劑建立Wistar大鼠腎結石模型，分時段處死大鼠并對大鼠腎結石形成過程進行動態觀察，為腎結石病因學等方面的研究提供動物實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2016年3月選取6周齡左右SPF級雄性Wistar大鼠60只，體質量（200±20）g，購自新疆醫科大學實驗動物中心〔合格證號SCXK（新）2013-0001〕。SPF級雄性Wistar大鼠均先適應性飼養1周后隨機分為空白對照組（NC組，n=30）和EG組（n=30）。

1.2 實驗材料 基本飼料（石河子大學實驗動物中心）、電子天平（LT1000B，常熟市天量儀器有限責任公司）、全自動生化分析儀（Modual DPP，德國羅氏）、多功能光學顯微鏡及圖像采集系統（BX40，日本Olympus）、紅外光譜自動分析儀〔LIIR-20，藍莫德（天津）科學儀器有限公司〕、透射電鏡〔JEOL-1230 Electronics，日本電子株式會社（JEOL）〕、微計算機斷層掃描技儀（Micro-CT，skyscan1176，比利時Antwerpen）。

1.3 方法

1.3.1 傳統EG、氯化銨溶液配制 EG溶液配制：用100 ml量筒量取10 ml EG（分析純），加自來水定容至1 000 ml，配得1%EG溶液（現配現用）。氯化銨溶液配制：用電子天平稱取2 g氯化銨晶體（分析純），同時用量筒量取1 000 ml無菌雙濾水，將兩者充分混勻后配得2%氯化銨溶液（現配現用）。

1.3.2 建立動物模型 NC組大鼠正常飲水，2 ml 0.9%氯化鈉溶液灌胃2周；EG組大鼠飲用1% EG溶液，2 ml 2%氯化銨溶液灌胃2周。繼續飼養8周，NC組大鼠正常飲水，EG組大鼠飲用1% EG溶液，標準飼料飼養，均不限制飲用自來水。

1.3.3 一般情況觀察 連續10周觀察各組大鼠飲食飲水情況、行為活動等，并測量其體質量（g）。

1.3.4 標本采集 兩組大鼠自第1周造模開始，每周處死3只。大鼠處死前1 d用代謝籠收集大鼠24 h尿液。將大鼠用10%水合氯醛以4 ml/kg腹腔內注射麻醉，待大鼠肌肉松弛后腹部正中切口，打開腹部暴露腎臟及下腔靜脈，抽取靜脈血3～4 ml行血生化檢測。切取大鼠雙側腎組織，沖洗后稱重，快速冰凍保存，供HE染色用，并計算腎體比，腎體比=腎臟重量/體質量×100%。采用粗針頭挑取腎臟冠狀剖面附近組織約0.5 g，烘干后供結石分析用。

1.3.5 檢測指標 采用全自動生化分析儀檢測血肌酐、血尿酸、尿素氮、尿鈣、血鈣、血磷、血鎂、尿pH值、尿比重。采用解剖顯微鏡進行結石晶體形成觀察，肉眼觀察腎臟的顏色、形狀及大小。將冰凍后腎臟標本快速包埋，制成5 μm厚的橫斷切片，將切片固定于載玻片上，常規HE染色切片，光學顯微鏡下觀察結晶的形成情況及腎臟病理變化情況，按文獻［4］提供的腎臟結晶分級判定標準進行統計。采用紅外光譜自動分析儀進行結石成分的分析。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以（x ±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗；等級資料比較采用秩和檢驗。雙側檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 兩組大鼠一般情況觀察 觀察期間EG組大鼠墊料有血尿，造模期間于第8周死亡1只，第9周死亡1只。造模1～2周時兩組大鼠進食良好、安靜溫順。造模3～8周時，NC組大鼠無特殊表現，EG組大鼠表現為煩躁興奮、活潑好動。造模9～10周EG組大鼠表現為精神疲倦，針刺反應遲鈍，活動度減少，食量減少；NC組大鼠無特殊表現。

2.2 大鼠血、尿生化指標比較 EG組大鼠第2～10周血肌酐、血尿酸均高于NC組，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組大鼠第1周血肌酐、血尿酸比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。EG組大鼠第3～8周尿素氮高于NC組，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組大鼠第1、2、9、10周尿素氮比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。EG組大鼠第2周、第4～10周尿鈣高于NC組，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組大鼠第1、3周尿鈣比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。EG組大鼠第5～10周血鈣高于NC組，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組大鼠第1～4周血鈣比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。EG組大鼠第6～10周血磷、血鎂高于NC組，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組大鼠第1～5周血磷、血鎂比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。EG組大鼠第2～8周尿pH值低于NC組，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組大鼠第1、9、10周尿pH值比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。兩組大鼠第1～10周尿比重、尿量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。EG組大鼠第3～10周腎體比高于NC組，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組大鼠第1～2周腎體比比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表1）。

2.3 肉眼及解剖顯微鏡觀察 造模第1～2周，肉眼觀察兩組大鼠腎臟無明顯差異。造模第3周開始，肉眼觀察EG組大鼠部分腎臟較NC組略有增大，腎皮質剖面呈紅褐色，髓質呈橘黃色，皮髓結構清晰，腎盞及腎盂良好。造模第6周以后，肉眼觀察EG組大鼠腎臟腫大，顏色變淺或發白，剖面呈淡黃色，皮髓結構不清晰，可見淡黃色顆粒沉積在皮髓交界處，觸之有沙粒樣感覺；解剖顯微鏡下可見晶體以腎盂為中心呈扇形分布。造模第6周以后，肉眼觀察NC組大鼠腎臟表面光滑，腎皮質剖面為暗紅色，髓質呈灰白色，腎門處可見腎乳頭、腎盞、腎盂等正常結構，未見明顯斑點顆粒；解剖顯微鏡下亦未見明顯結晶（見圖1）。

表 1 不同時間點兩組大鼠血、尿生化指標變化（x±s）Table 1 Changes in blood，urine biochemical indices of rats in the two groups at different time points

（續表1）

2.4 腎臟結晶及結石情況

2.4.1 兩組大鼠腎臟結晶分級形成情況及比較 整個研究期間，NC組大鼠腎臟組織未見結晶，EG組大鼠造模第3周起腎臟切片可見明亮晶體，主要分布于遠曲小管、近曲小管及部分腎小球周圍，形態不規則，晶體多呈零星散在分布，少量晶體呈互相連接成片或成堆。EG組大鼠腎臟結晶分級高于NC組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

2.4.2 兩組大鼠腎臟病理變化情況 光學顯微鏡下觀察：造模期間NC組大鼠腎臟組織內未見結晶沉積，無病理學改變。造模第2周起EG組部分大鼠腎臟組織內可見腎小管上皮細胞脫落或腎間質淋巴細胞浸潤以及數量不等透明晶體，多數晶體以不規則碎片出現在腎小管中，部分見于集合管、間質及被膜下，并伴有部分腎小管擴張、上皮細胞空泡樣變性及小管上皮腫脹；造模第5～10周大鼠腎臟組織結晶量大，細胞排列紊亂，腎小管多畸形，腎小管管腔擴大或因上皮細胞腫脹而變窄，擴大腔內多有壞死脫落樣物，腎小球形狀多不規則甚至壞死（見圖2）。

表 2 兩組大鼠腎臟結晶分級比較（只）Table 2 Grading of crystallization in the two groups

圖1 兩組大鼠腎臟的剖面圖Figure 1 Cross section of kidneys in the two groups of rats

圖2 兩組大鼠腎臟的冰凍切片（HE染色，×200）Figure 2 Frozen sections of kidneys in the two groups of rats

2.5 兩組大鼠結石成分分析及結石檢出率比較 NC組大鼠腎結石成分：草酸鈣結石1例（6.6%），磷酸鎂銨結石1例（3.3%），結石檢出率為6.7%（2/30）。EG組大鼠腎結石成分：草酸鈣結石7例（23.3%），草酸鈣+磷酸鈣結石5例（16.7%），草酸鈣+磷酸鎂銨結石3例（9.9%），磷酸鎂銨結石1例（3.3%），磷酸鈣結石3例（9.9%），結石檢出率為63.3%（19/30）。EG組大鼠結石檢出率高于NC組，差異有統計學意義（χ2=21.172，P＜0.001）。

3 討論

腎結石是一種全球性常見病和多發病，其患病率為5%～15%；腎結石成分中約80%為鈣結石，其中以草酸鈣結石最常見［5］。大鼠腎臟草酸鈣結石模型的成功建立是研究腎結石形成機制的基礎。目前有關草酸鈣結石的形成機制研究雖尚未達成一致性結論，很多因素均可以導致腎結石的形成，例如低尿量、高尿鈣、尿草酸、尿pH值，其中草酸是結石形成的重要因素。本研究造模用到的EG是目前大鼠草酸鈣結石模型造模的基礎促石劑，其是草酸的前體，進入體內后轉化為羥乙酸，其在羥乙酸氧化酶的作用下可直接變為草酸，也可通過乳酸脫氫酶的作用轉化為乙醛酸，然后再轉化為草酸［6］。氯化銨可以酸化尿液，長期服用可造成腎小管功能障礙，有利于草酸鈣晶體形成，而氯化銨是一種刺激性物質，大鼠難飲用，故配成2%氯化銨溶液灌胃2周。目前，雖然通過EG加氯化銨法建立大鼠草酸鈣結石模型已成熟，但是大多數是在建立模型之后一次性處死取石［3］，對于大鼠草酸鈣結石成石過程中的動態變化方面的研究較少，因此本研究采用EG加氯化銨法建造Wistar大鼠腎結石模型，連續觀察10周，分期處死，動態觀察整個結石形成過程。

本研究結果顯示，造模過程中EG組大鼠墊料有血尿，造模期間有2只大鼠死亡，此結果可能與EG及氯化銨的腎毒性有關。造模早期兩組大鼠無特殊變化；造模第3～8周時，NC組無特殊表現，EG組大鼠較NC組大鼠更煩躁，活動增加。造模第9～10周時，EG組大鼠較NC組大鼠精神疲倦，活動度減少，食量減少；NC組大鼠無特殊表現，此表現可能與EG及氯化銨造成腎損傷至晚期大鼠腎衰竭有關。肉眼觀察EG組大鼠腎組織結晶明顯，而NC組無明顯變化。在腎臟結晶分析及結石形成上，NC組大鼠無結晶形成；EG組大鼠結石檢出率較NC組大鼠高，此結果與其他研究結果相符［3］。本研究結果顯示，EG組大鼠第2～10周血肌酐、血尿酸高于NC組，第3～8周尿素氮高于NC組，第2周、第4～10周尿鈣高于NC組；此結果說明EG組在造模早期即出現腎功能損傷，與相關文獻報道的高草酸及氯化銨等可以傷及腎小管上皮，引起炎性反應，導致上皮細胞的脫落，使基底膜暴露相符［7］。本研究結果顯示，EG組大鼠第5～10周血鈣高于NC組；EG組大鼠第6～10周血磷、血鎂高于NC組；EG組大鼠第2～8周尿pH值低于NC組；表明EG加氯化銨造模法對腎臟損傷較重，對腎功能影響程度較大。EG組大鼠第3～10周腎體比高于NC組，表明造模對腎臟形態結構改變較明顯。

本研究結果顯示，腎臟病理切片中EG組大鼠腎臟內可見鈣鹽結晶沉積，主要分布于腎小管，NC組大鼠腎組織未見晶體。EG組大鼠腎小管內鈣鹽晶體沉積較多，伴有部分腎小管上皮細胞空泡樣變性及腎小管上皮腫脹，偶可見腎間質淋巴細胞浸潤或腎小管上皮脫落；NC組腎臟組織未見病理改變。此結果與傳統EG加氯化銨造模機制相符［8］。

腎小管細胞損傷學說是腎結石發病機制的主要學說之一。VERVAET等［9-10］研究證實，在結石形成的起始階段出現腎小管上皮細胞的受損，流經腎小管的原尿結晶鹽容易黏附于受損的腎小管上皮細胞，繼而聚集形成更大的結晶或結石。同時細胞損傷之后形態亦發生改變，其緊密連接結構被破壞，磷脂雙分子層不再對稱，膜的極性消失，細胞的防御機制被破壞［11］，以致腎結晶的黏附及進一步形成結石，結石形成可能持續壓迫腎臟引起機械性的損傷及腎臟的缺血缺氧，腎臟損傷風險增加［12］。KHAN等［13］研究發現，持續性高草酸尿會導致上皮細胞出現一系列形態學改變，最終導致細胞壞死并脫落，基底膜暴露，有利于結石的附著。同時，細胞受損后產生的碎片有助于結晶的核化和生長。在建造腎結石模型時添加可致腎小管上皮細胞損傷的藥物，可增強成石作用，縮短造模時間。本實驗使用到的EG可在體內轉化成草酸，而高草酸尿可致腎小管壞死［14］，聯合氯化銨對腎小管上皮細胞造成損傷，使結晶更容易聚集形成結石。

雖然本實驗對大鼠腎結石成石過程進行了動態觀察，但未從細胞層面上對成石過程中大鼠腎臟損傷進行動態觀察，此處還有待后續深入研究。

綜上所述，采用EG加氯化銨法建立的腎結石模型大鼠在造模第3周開始形成結石，腎結石模型大鼠明顯較空白對照大鼠精神疲倦，活動度及飲食量減少，血、尿生化指標明顯改變，腎體比明顯升高。本研究通過分析大鼠腎結石模型血尿生化、病理切片及結晶分級對模型動物腎結石發展的各個階段有了較為清楚的了解，在10周時間內完整復制了大鼠草酸鈣結石模型，明確了各個時間段的結石形成情況，較好地再現了腎結石發展的過程，并對其動態觀察，為腎結石發生的機制及預防治療、結石形成過程中各個階段腎臟的變化提供了理想的動物模型及相關數據。