高通量測序技術進行流產組織染色體拷貝數檢測的結果分析

張釧，郝勝菊*，張慶華，馮暄，林曉娟，劉芙蓉，周秉博，閆有圣

(1.甘肅省婦幼保健院，甘肅省出生缺陷防控研究重點實驗室，蘭州 730050；2.國家衛生計生委科學技術研究所，北京 100081)

自然流產是指妊娠不滿28周、胎兒體重不足1 000 g，妊娠自行終止；妊娠12周之內終止稱為早期流產。自然流產的發生率為15%～40%，而其中80%以上為發生在12周內的早期流產[1]。臨床上，胚胎或胎兒已經死亡，卻一直滯留于宮腔內不排出，稱為稽留流產[2]。自然流產的病因十分復雜，孕早期的流產原因中，約有60%為胚胎染色體異常引起[2]。目前，對流產絨毛進行核型分析，是檢測染色體異常的重要方法。但絨毛細胞采樣及培養要求高，培養成功率低，分辨率也低，難以得到滿意的結果[3-5]。本研究通過高通量測序進行染色體 DNA 拷貝數(Genomic copy number variations，CNVs)檢測和常規染色體核型來進行流產原因分析，探討高通量測序技術在流產染色體檢測中的應用價值。

資料方法

一、資料來源

收集2015年11月至2017年11月在甘肅省婦幼保健院產科門診確診的自然流產、稽留流產組織以及絨毛組織，共計266例。患者年齡介于14～43歲，胚胎停育孕周介于孕4～26 周之間，自然流產患者樣本190例、稽留流產組織40例、絨毛組織36例。流產(或引產)前B超檢查均提示胚胎(胎兒)停止發育或有嚴重畸形，所有標本均在患者知情同意的原則下采集，然后進行絨毛細胞培養及染色體核型分析，同時將所有266例流產樣本提取基因組DNA后進行高通量測序。檢測均獲患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

二、方法

1.絨毛細胞的培養及染色體核型分析：在嚴格無菌的條件下進行宮腔鏡清宮術，采集胚胎絨毛標本，按照本中心建立的常規方法進行細胞培養、收獲、制片、G顯帶，核型分析。

2.高通量測序：基因組DNA提取使用德國QIAGEN公司生產的基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書進行。DNA濃度控制在 50～250 ng/μl，-20℃保存。采用高通量測序文庫構建試劑盒(北京貝瑞和康)完成CNV文庫構建，操作嚴格按照試劑操作說明書進行。主要步驟包括：DNA末端修復，通用測序引物及樣本識別標簽(Barcodes)連接，文庫構建產物純化。構建完成 的文庫采用美國KAPA SYBR FAST qPCR試劑盒對文庫進行準確定量。構建成功的文庫根據每個樣本文庫的濃度進行混合(Pooling)，將混合的文庫在本實驗室建立的NestSeq CN500高通量測序儀平臺上進行大規模測序，最小精度在100 Kb，測序深度1 X。測序結果經信息分析，將每個測序 Reads匹配到其所在的染色體上。隨后做相應標準化Z值分析，通過Z值進行染色體異常判定。通過檢索 DECIPHER、OMIM、ClinVar、DGV等數據庫進行CNV臨床意義的確定。

結 果

一、染色體核型分析結果

200例絨毛細胞獲得培養成功，66例由于是稽留流產或者孕周偏大培養失敗。共檢測出染色體核型異常79例，其中單體17例、三體61例、雙重三體1例(表1)。

表1 染色體核型分析結果

二、CNVs分析結果

266例基因組DNA標本中，4例由于DNA降解而檢測失敗，其余標本均檢測成功。共檢測出CNVs改變155例，其中致病性CNVs改變119例，包括非整倍體112例，其中單體26例、三體83例、雙重三體3例(表2)；致病性缺失或者重復7例(表3)。此外檢出致病性未知CNVs 2例(表3)、多態性改變CNVs 34例。

表2 CNVs分析非整倍體檢測結果

表3 致病性CNVs與致病性未知CNVs分析

注：*為致病性未知CNVs

討 論

染色體異常包括數目和結構異常，其中數目異常包含整倍體改變和非整倍體改變，染色體非整倍體中三體較為常見；結構異常包括缺失、重復、倒位、易位、插入、環狀染色體和等壁染色體等。這些變異均會產生相應的遺傳學效應，可能會導致變異個體表型發生嚴重改變，甚至死亡[6]。

常規G顯帶核型正常的細胞中也存在亞顯微結構變異，包括染色體的微缺失、微重復等各種類型的CNVs[7]。基因組中約有 4.8%～9.5%變異屬于CNVs，其中99%以上的 CNVs 是良性的，但剩余的 1%常導致嚴重的染色體疾病[8]。CNVs可能通過干擾基因表達影響妊娠，最終導致胎兒死亡和流產。CNVs 的可能致病機制包括CNVs的劑量效應及位置效應[9-10]、造成某些隱性致病基因的暴露[11-12]、產生新的融合基因或者打斷某個與疾病相關的基因[13]。

本文研究了266例流產樣本的拷貝數變異，無論核型分析還是高通量測序分析結果，流產物的拷貝數變異均以非整倍體改變為主。核型分析異常檢出率為39.5%，其中，21號染色單體1例、X染色體單體16例、三體61例、雙重三體1例；三體中21-三體最常見，其次為16-三體、22-三體、14-三體、15-三體等。高通量測序分析異常檢出率為45.4%,其中單體26例[21.8%；(45,XN,-21)和(45,XN,-22)各1例，(45,X0)24例]；三體83例(69.7%)，三體分布情況與核型分析一致；雙重三體3例(2.5%)；致病性缺失或者重復7例(5.9%)。

本文研究對象中，262例樣本的拷貝數變異檢測成功，除發現非整倍體改變112種外，發現CNVs 43種，檢出率為16.4%。其中致病性CNVs 7例(16.3%)、致病性未知CNVs 2例(4.7%)、多態性改變CNVs 34例(79.1%)。可見，對流產物進行拷貝數變異分析可提高異常檢出率，更好地發現流產的遺傳學病因。

用原位熒光雜交技術進行流產物分析意義不大，檢出率低[14]，而細胞培養和核型分析，培養成功率較低[3-5]。雖然流產絨毛細胞培養和核型分析成功率較低，但目前染色體核型分析仍是臨床最基本的遺傳學檢查。高通量測序技術可覆蓋全基因組進行拷貝出變異分析，除了可以發現非整倍體改變外，還可發現致病性及可能致病性CNVs，可明顯提高異常檢出率。臨床上，可采用染色體核型分析與高通量測序技術相結，以全面地發現染色體異常改變，從而查明流產的遺傳學病因，減輕患者的心理負擔，為再次妊娠提供臨床建議和遺傳咨詢。