一株白牦牛源牛病毒性腹瀉病毒E0基因的原核表達(dá)與序列分析

馬 鵬，李林杰，常秋燕，王悅縈，馬曉霞，馬忠仁 *

(1.西北民族大學(xué) 甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

【研究意義】牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)屬于黃病毒科(Flaviviridea)瘟病毒屬(Pestivirus)，可引起牛病毒性腹瀉-黏膜病(BVD-MD)。流行病學(xué)調(diào)查顯示，在世界范圍內(nèi)，BVDV在畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家流行形勢(shì)依然嚴(yán)峻。而BVDV在中國(guó)的流行也呈上升趨勢(shì)，涉及面達(dá)全國(guó)20多個(gè)省，包括內(nèi)蒙古、甘肅、青海、新疆等。國(guó)內(nèi)研究人員通過(guò)血清學(xué)方法檢測(cè)到牦牛體內(nèi)存在BVDV持續(xù)性感染，其血清抗體陽(yáng)性率高達(dá)72.14 %[1]；鄧宇等[2]對(duì)來(lái)自全國(guó)11個(gè)省份的511份豬病料樣品進(jìn)行了檢測(cè)，BVDV陽(yáng)性率高達(dá)23.1 %～33.6 %。由此可見(jiàn)BVDV不僅對(duì)反芻動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重威脅，同樣也威脅著養(yǎng)豬業(yè)。【前人研究進(jìn)展】BVDV基因組分為5′非翻譯區(qū)(5′-UTR)、開放閱讀框架區(qū)(ORF)和3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)，ORF編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白和8種非結(jié)構(gòu)蛋白，C、E0、E1、E2為結(jié)構(gòu)蛋白[3]。編碼這11種蛋白質(zhì)的基因在基因組上相對(duì)位置為5′-P20(NPRO)-P14(C)-gp48(E0)-gp25(E1)-gp53(E2)-P7-P125(NS2-3)-P10(NS4A)-P30(NS4B)-P58(NS5A)-P75(NS5B)-3′[4]，其中P14、gp48、gp25、gp53是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。

囊膜蛋白E0，位于ORF的811-1491位核苷酸，由227個(gè)氨基酸殘基組成，有9個(gè)可糖基化位點(diǎn)，去糖基化形式分子質(zhì)量約為27 ku。在病毒粒子中，E0以100 ku大小的同聚體存在，在細(xì)胞信號(hào)肽酶作用下，其N末端從多聚蛋白上裂解下來(lái)，可被分泌到宿主細(xì)胞外，E0蛋白有其特有的RNase活性[5]，但該活性在瘟病毒增殖及使機(jī)體致病過(guò)程中所起的作用還不清楚，對(duì)E0蛋白R(shí)Nase活性的研究有可能為預(yù)防病毒感染找到新的途徑。E0是BVDV編碼蛋白中保守性很高的蛋白，其上有中和表位，刺激機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體具有中和BVDV和HCV抗原的能力[6]。氨基酸序列分析結(jié)果表明，在這一蛋白內(nèi)有一高度保守結(jié)構(gòu)域，因此它可用于研究基因工程亞單位疫苗，也可作為基因工程診斷抗原。【本研究切入點(diǎn)】本研究通過(guò)對(duì)BVDV E0基因的克隆、表達(dá)和進(jìn)化樹分析對(duì)BVDV GSTZ株進(jìn)行分型研究，確定GSTZ株所屬的基因型，為研究BVDV GSTZ株掌握相關(guān)數(shù)據(jù)。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)對(duì)E0基因的抗原表位預(yù)測(cè)，為后續(xù)開發(fā)BVDV檢測(cè)試劑盒或是研制相關(guān)疫苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 牛腎細(xì)胞(Madin-Darby bovine kidney cell，MDBK)甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心保藏。

1.1.2 主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒，DNA純化回收試劑盒，北京博凌科為生物科技有限公司；普通質(zhì)粒小提試劑盒，蘭州美伯生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；One Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒、XhoⅠ和BamHⅠ，寶生物工程(大連)有限公司；兔抗牛IgG，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Bio-Rad電泳儀、轉(zhuǎn)印槽，美國(guó)伯樂(lè)有限公司產(chǎn)品；PCR儀、化學(xué)發(fā)光儀，北京市六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中的不同BVDV毒株，其中14株BVDV I型，登錄號(hào)分別為NC_001461、U86600、U86599、AF091605、AF268278、AB078952、AB078950、M96687、AJ585412、M96751、AF526381、DQ088995、EF101530和U63479；7株BVDV II型，登錄號(hào)分別為AF002227、AY149216、AF502399、AY149215、FJ527854、GQ888686和AB567658，將21株BVDV E0基因序列進(jìn)行比對(duì),利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增E0基因的引物：

Forward：5′-CGGGATCCATAACACAGTGGAACTTACAGGATA-3′

Reverse：5′-CGCTCGAGCGCATAGCCCCAAACCATGTCCTA-3′

1.2.2 病毒RNA的提取 將從牦牛血清中分離得到的BVDV GSTZ株接種到MDBK細(xì)胞中進(jìn)行增殖，每隔24 h進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞發(fā)生病變后，收細(xì)胞。將細(xì)胞反復(fù)凍融3次，使用RNA提取試劑盒提取病毒RNA，置于-80 ℃保存，備用。

1.2.3 目的基因的擴(kuò)增 使用One Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：2×One Step Mix 25 μl；上下游引物各1 μl；One Step Enzyme Mix 2 μl；RNase free ddH2O 16 μl；模板5 μl。反應(yīng)條件：42 ℃ 30 min；94 ℃ 3 min；94 ℃ 變性30 s；55 ℃ 復(fù)性 30 s；72 ℃ 延伸 1 min，共計(jì)25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳，回收目的基因置于-20 ℃保存，備用。

1.2.4 克隆載體和表達(dá)載體的構(gòu)建 把E0基因插入克隆載體pMD18-T中，構(gòu)建pMD18-T-E0，將克隆好的載體送金唯智測(cè)序。將pET-28a和pMD18-T-E0分別用BamHI和XhoI雙酶切，回收酶切產(chǎn)物于22 ℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，在含有卡那霉素的LB平板上篩選陽(yáng)性克隆，挑取單克隆培養(yǎng)，提質(zhì)粒pET-28a-E0，使用BamH I和XhoI進(jìn)行雙酶切鑒定并測(cè)序。

1.2.5 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及Western blot鑒定 將pET-28a-E0轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，12 h后挑斑搖菌。取活化的菌液按1∶100的比例接種到新的培養(yǎng)基中，待其OD值達(dá)到0.6～0.8之間，加入1.0 mmol/L IPTG，在37 ℃搖床中培養(yǎng)4 h。4 h后收集菌液，離心收集沉淀，加入裂解液冰浴裂解30 min，加入蛋白上樣液煮樣10 min。將處理后的樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將目的蛋白濕轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加封閉液室溫封閉1 h。用封閉液1∶5000稀釋感染BVDV陽(yáng)性血清反應(yīng)1 h，洗膜3次，每次20 min。用封閉液1∶5000稀釋二抗(兔抗牛IgG)反應(yīng)1 h，洗膜3次，每次20 min。加TWB顯色液暗室顯色3 min。

1.2.6 BVDV E0基因序列分析 從GenBank中找出20株牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)E0基因序列，3株邊界病病毒(BDV)E0基因序列，6株豬瘟病毒(CSFV)E0基因序列，應(yīng)用DNAstar中Clustal W Method和MEGA 5軟件對(duì)E0基因的核苷酸序列與上述已知序列進(jìn)行同源性分析與比較，繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹并分析。

1.2.7 BVDV E0蛋白抗原表位的預(yù)測(cè) 使用DNAstar分析軟件，來(lái)分析E0蛋白B細(xì)胞抗原表位和潛在優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞抗原表位。使用Gamier-Robso對(duì)E0蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲。預(yù)測(cè)E0蛋白質(zhì)骨架的柔韌性、蛋白表面可及性和蛋白的抗原性分析分別應(yīng)用了Karplus-Schulz方法、和Emini方法和Jameson-wolf方法。綜合蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、蛋白骨架的柔韌性以及蛋白的抗原性，以此預(yù)測(cè)E0蛋白的B細(xì)胞抗原表位。

在DNAstar中，用AMPHI法和Rothbard-Taylor方法綜合性預(yù)測(cè)E0蛋白潛在的優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞抗原表位。

2 結(jié)果與分析

2.1 E0基因擴(kuò)增及測(cè)序

以RNA為模板，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增，1 %瓊脂糖凝膠電泳得到大約675 bp的目的條帶(圖1)，將EO基因克隆至pMD18-T中，進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，BVDV E0基因序列全長(zhǎng)為675 bp(圖2)。

M.Marker:DL2000; 1. E0基因; 2. 陰性對(duì)照M.Marker:DL2000; 1. E0 gene; 2. Negative control圖1 E0基因的克隆Fig.1 E0 gene cloning

2.2 pET-28a-E0表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

通過(guò)雙酶切、單酶切和PCR鑒定，得675 bp目的條帶與預(yù)期結(jié)果相符(圖3)，表明已成功構(gòu)建了pET-28a-E0的原核表達(dá)載體。

2.3 SDS-PAGE和Western blot鑒定結(jié)果

將pET-28a-E0轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，加入1.0 mmol/L IPTG、在37 ℃搖床中誘導(dǎo)4 h后收集菌液，離心收集細(xì)胞。加入裂解液冰浴裂解30 min，離心取上清，制成SDS樣品。對(duì)pET-28a-E0質(zhì)粒表達(dá)得到的融合蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，加入TWB顯色后在相對(duì)分子質(zhì)量大約27 ku位置有目標(biāo)條帶(圖4)。

2.4 E0基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

根據(jù)GenBank中已經(jīng)公布的序列中，找出20株BVDV E0基因序列(序列號(hào)：U86600、U86599、AF091605、AF268278、AF002227、AB078952、AB078950、M96687、AY149216、AJ585412、M96751、AF502399、AF526381、DQ088995、EF101530、AY149215、FJ527854、GQ888686、AB567658、U63479)，3株BDV E0基因序列(序列號(hào)：GU270877、AF037405、U70263)，6株CSFV E0基因序列(序列號(hào)：X87939、X96550、U90951、U45478、U45477、NC_002657)。使用生物信息學(xué)軟件DNAstar中Clustal W Method和MEGA 5中的Neighbor-Joining程序?qū)ι鲜?0株E0基因序列進(jìn)行同源性分析，同源性分析結(jié)果如圖5所示，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹如圖6所示(重復(fù)次數(shù)為1000)。

圖2 BVDV GSTZ E0基因序列全長(zhǎng)和氨基酸序列Fig.2 BVDV GSTZ E0 gene sequence and amino acid sequence

M.Marker DL10000; 1.重組質(zhì)粒 PCR; 2.重組質(zhì)粒用 BamH I酶切; 3.重組質(zhì)粒用 BamH I、XhoI酶切M.Marker DL10000; 1.Amplification products of recombinant plamid; 2.Recombinant plamid digested with BamH I; 3.Recombinant plamid digested with BamH I and XhoI圖3 重組質(zhì)粒鑒定Fig.3 Identification of recombinant plamid by enzyme digestion

M. Marker; 1.pET-28a-E0上清; 2.陰性對(duì)照M. Marker; 1.pET-28a-E0 supernatant; 2.Negative control圖4 Western blotFig.4 Western blot

同源性分析結(jié)果顯示，GSTZ株與SD-1株、Singer_Arg株、NS3株和C24V序列相似性分別為85.9 %、87.1 %、85.5 %和85.3 %；BDV和CSFV與BVDV同屬于黃病毒科、瘟病毒屬，三者比較發(fā)現(xiàn)E0基因序列的同源性均相對(duì)較低。在進(jìn)化樹中顯示與GSTZ株進(jìn)化關(guān)系較近SD-1株和C24V株屬于牛病毒性腹瀉病毒-1a亞型，Osloss株和VEDEVAC株屬于牛病毒性腹瀉病毒-1b亞型；與GSTZ株進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)的ZM-95則屬于牛病毒性腹瀉病毒-1f亞型。由此可以推斷出牛病毒性腹瀉病毒GSTZ株基因型可能屬于牛病毒性腹瀉病毒-1a亞型，也可能是其他基因亞型發(fā)生較大突變產(chǎn)生變異。

圖5 E0基因的同源性分析Fig.5 E0 gene homology analysis

圖6 E0基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of E0 gene

圖5顯示，牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、邊界病病毒(BDV)和豬瘟病毒(CSFV)同屬于黃病毒科瘟病毒屬，但是從進(jìn)化樹中可看出，三者彼此之間進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖7 E0蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.7 Prediction results of E0 protein secondary structure

圖8 E0蛋白親水性和疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.8 Prediction of hydrophilicity and hydrophobicity of E0 protein

圖9 E0蛋白質(zhì)骨架柔韌性分析結(jié)果Fig.9 E0 protein framework flexibility analysis results

2.5 E0蛋白抗原表位的預(yù)測(cè)

2.5.1 E0蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，只有β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲呈現(xiàn)凸出狀，具有柔韌性，可發(fā)生變形，較多出現(xiàn)在蛋白表面，有利于與抗體相結(jié)合，因此存在較大可能為抗原表位。與之相反的是，α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)規(guī)則不易發(fā)生變形，一般不作為抗原表位。所以，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)預(yù)測(cè)β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲。β-轉(zhuǎn)角在：21-22、29-30、36-37、62-65、73-82、101-102、115-119、127-128、136-140、149-150、215-219位氨基酸殘基，共有41氨基酸。無(wú)規(guī)卷曲在：6-12、23-24、26-28、40-41、85-86、94-97、103-104、151-152、185-187、224-225位氨基酸殘基，共有29個(gè)氨基酸(圖7)。

2.5.2 E0蛋白親水性和疏水性預(yù)測(cè) E0蛋白的親水區(qū)主要位于：1-32、44-46、49-50、56-85、94-121、123-134、136-142、152-154、163-172、174-175、178-179、182-183、185-197、200-201、207-208、211-222位氨基酸殘基，共有162個(gè)氨基酸(圖8)。

2.5.3 E0蛋白質(zhì)骨架柔韌性分析 E0蛋白質(zhì)骨架柔韌性區(qū)域主要位于：7-15、22-26、32-34、38-41、59-63、94-106、115-120、125-141、151-152、174-175、183-200、203-204、210-219位氨基酸殘基，共有96個(gè)氨基酸(圖9)。

2.5.4 E0蛋白表面可及性分析 E0蛋白表面可及性區(qū)域主要位于：4-10、17-18、22-23、47-48、58-63、70-76、83-85、93-98、100-105、113-118、125-130、138-140、167-168、175-176、186-187、189-194、211-218位氨基酸殘基，共有76個(gè)氨基酸(圖10)。

2.5.5 E0蛋白抗原性分析E0蛋白含有的抗原性區(qū)域主要位于：5-15、18-27、35-37、40-41、45-51、57-65、68-82、93-110、112-120、125-132、134-142、151-154、158-159、162-172、184-197、209-219位氨基酸殘基，共有143個(gè)氨基酸(圖11)。

2.5.6 E0蛋白B細(xì)胞抗原表位分析 根據(jù)上述結(jié)果中對(duì)E0蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、蛋白骨架的柔韌性以及蛋白的抗原性的預(yù)測(cè)，得出E0蛋白B細(xì)胞的抗原表位主要位于：7-12、22-26、62-63、94-97、101-105、115-119、127-128、138-140、185-187、215-219位氨基酸殘基，共有40個(gè)氨基酸，占整個(gè)氨基酸序列的17.6 %(圖12)。

2.5.7 E0蛋白T細(xì)胞抗原表位分析 使用AMPHI法和Rothbard-Taylor方法分析得出E0蛋白T細(xì)胞潛在優(yōu)勢(shì)抗原區(qū)域主要位于：10-14、19-31、36-43、52-58、77-86、96-98、137-140、148-150、167-191、209-211位氨基酸殘基，共有51個(gè)氨基酸，占全部氨基酸序列的22.5 %。

3 討 論

E0蛋白是一種高度糖基化的蛋白，其與病毒粒子相關(guān)，而且E0可由被BVDV感染的細(xì)胞以可溶性蛋白的方式分泌出細(xì)胞外[7]。E0蛋白通過(guò)C末端的兩親性螺旋松散地附著在病毒顆粒的表面，這種弱相互作用允許E0從病毒顆粒解離[8]。E0還具有一個(gè)獨(dú)特的特征——RNase活性，該功能在先天免疫應(yīng)答中有重要作用[9]。

圖10 E0蛋白表面可及性分析結(jié)果Fig.10 Analysis of surface accessibility of E0 protein

圖11 E0蛋白抗原性分析結(jié)果Fig.11 Antigenic analysis results of E0 protein

圖12 E0蛋白T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.12 E0 protein T cell epitope prediction results

當(dāng)前，對(duì)牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)疫苗的研制我國(guó)還相對(duì)滯后，但是隨著BVDV疫情不同程度的爆發(fā)，給牧民帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，有必要研究BVDV疫苗，以保護(hù)農(nóng)牧民的利益不受損害，進(jìn)一步保護(hù)食品安全。在先前的研究中發(fā)現(xiàn)，E0能中和BVDV和HCV(丙型肝炎病毒)。

本研究中，根據(jù)DNAstar軟件預(yù)測(cè)到，整個(gè)E0序列二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-轉(zhuǎn)角區(qū)域共有41氨基酸，占全部氨基酸序列的18.1 %。無(wú)規(guī)卷曲共有29個(gè)氨基酸，占全部氨基酸序列的12.8 %。經(jīng)預(yù)測(cè)，其親水區(qū)域共有162個(gè)氨基酸，占全部氨基酸序列的71.4 %，表面可及性區(qū)域包括76個(gè)氨基酸，占全部的33.5 %。通過(guò)抗原性分析，其抗原性區(qū)域主要在5-15、18-27、35-37、40-41、45-51、57-65、68-82、93-110、112-120、125-132、134-142、151-154、158-159、162-172、184-197、209-219位氨基酸殘基，共有143個(gè)氨基酸，占全部氨基酸的63.0 %。綜合上述全部分析結(jié)果，預(yù)測(cè)E0蛋白B細(xì)胞的抗原表位主要位于：7-12、22-26、62-63、94-97、101-105、115-119、127-128、138-140、185-187、215-219位氨基酸殘基，共有40個(gè)氨基酸，占整個(gè)氨基酸序列的17.6 %。E0蛋白T細(xì)胞潛在優(yōu)勢(shì)抗原區(qū)域主要位于：10-14、19-31、36-43、52-58、77-86、96-98、137-140、148-150、167-191、209-211位氨基酸殘基，共有51個(gè)氨基酸，占全部氨基酸序列的22.5 %。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果分析，預(yù)測(cè)的B細(xì)胞抗原表位和T細(xì)胞潛在優(yōu)勢(shì)的抗原區(qū)域分別占整個(gè)氨基酸的17.6 %和22.5 %，說(shuō)明E0是一個(gè)B細(xì)胞抗原表位和T細(xì)胞抗原表位相差無(wú)幾的蛋白抗原，可更好利用此特性，為后續(xù)對(duì)BVDV檢測(cè)試劑盒的開發(fā)奠定一定的基礎(chǔ)。

本研究利用原核表達(dá)載體pET-28a在大腸桿菌中成功表達(dá)了E0蛋白，并且在實(shí)驗(yàn)中對(duì)E0蛋白表達(dá)的溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間分別進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的溫度為37 ℃、IPTG濃度為1.0 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為4 h時(shí)，蛋白的表達(dá)量最高。在試驗(yàn)中所使用的一抗為BVDV陽(yáng)性血清，二抗為兔抗牛抗體，在western blot結(jié)果中顯示蛋白的分子質(zhì)量約為27 ku，使用BVDV陽(yáng)性血清作為一抗，說(shuō)明E0具有良好的抗原性，在蛋白后期的純化以及使用E0蛋白來(lái)制備疫苗提供了很好的基礎(chǔ)。

隨著生物信息學(xué)和分子病毒學(xué)的不斷發(fā)展和完善，病毒的分類也在不斷的變化和發(fā)展。目前，BVDV的主要分類方式是由vilcek等在2001年根據(jù)BVDV 的5′-UTR和NPRO將BVDV分為了11個(gè)基因亞型[10]。根據(jù)同源性分析得出GSTZ株與SD-1株、Singer_Arg株、NS3株和C24V序列相似性較高，均高于85 %；相比較與BVDV同屬的BDV和CSFV，E0基因序列的同源性均相對(duì)較低，如圖5中所示，GSTZ與H2121和CAP的E0序列的同源性分別為69.5 %和68.6 %。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中的進(jìn)化關(guān)系的遠(yuǎn)近，可以看出GSTZ株與SD-1株、Singer_Arg株、NS3株和C24V關(guān)系較近，與ZM-95、Osloss、VEDEVAC等株距離較遠(yuǎn)。綜合同源性分析以及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹可以推斷出牛病毒性腹瀉病毒GSTZ株基因型可能屬于牛病毒性腹瀉病毒-1a亞型，也可能是其他基因亞型發(fā)生較大突變產(chǎn)生變異。

4 結(jié) 論

本研究中通過(guò)原核表達(dá)E0蛋白大小與預(yù)期結(jié)果相符且該蛋白具有良好的抗原性。基因序列的同源性分析以及構(gòu)建E0基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹表明牛病毒性腹瀉病毒GSTZ株基因型可能屬于BVDV-1a亞型，也可能是其他基因亞型發(fā)生較大突變產(chǎn)生變異。使用DNAstar預(yù)測(cè)E0蛋白B細(xì)胞的抗原表位主要位于：7-12、22-26、62-63、94-97、101-105、115-119、127-128、138-140、185-187、215-219位氨基酸殘基；T細(xì)胞潛在優(yōu)勢(shì)抗原區(qū)域主要位于：10-14、19-31、36-43、52-58、77-86、96-98、137-140、148-150、167-191、209-211位氨基酸殘基。整個(gè)研究表明E0蛋白具有良好的抗原性，通過(guò)對(duì)抗原表位預(yù)測(cè)以及對(duì)GSTZ進(jìn)行基因分型，為后續(xù)基因工程疫苗和BVDV檢測(cè)試劑盒的開發(fā)提供了理論依據(jù)。