腸復(fù)康方對(duì)大腸癌細(xì)胞多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用機(jī)制研究

貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550002

大腸癌是人們?nèi)粘Ｉ钪凶畛Ｒ姷膼盒阅[瘤之一[1]，伴隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的進(jìn)步以及生活水平的改進(jìn)，大腸癌的發(fā)病率在常見病中日益增長(zhǎng)。化療給人們帶來(lái)的治療效果不是很明顯，在很大程度上是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞已經(jīng)對(duì)化療藥物產(chǎn)生了耐藥性，并且這也一度被認(rèn)為是對(duì)腫瘤進(jìn)行化療等治療失敗的關(guān)鍵原因。腸復(fù)康是目前在臨床上針對(duì)大腸癌這一疾病治療的經(jīng)典方藥，并且普遍應(yīng)用在大腸癌放化療的過程中及大腸癌術(shù)后的中醫(yī)理療康復(fù)階段甚至癌癥晚期輔助保守治療。通過一定數(shù)量的臨床數(shù)據(jù)的分析及研究表明，腸復(fù)康經(jīng)方在大腸癌不同階段的治療過程中具有積極的治療作用。楊彥等[2]對(duì)腸復(fù)康膠囊治療大腸癌臨床療效研究發(fā)現(xiàn)，腸復(fù)康膠囊治療大腸癌有一定的治療效果，能夠有效的控制腫瘤的復(fù)發(fā)。腸復(fù)康抗腫瘤作用是否與逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥有關(guān)，本課題研究了腸復(fù)康抗腫瘤作用是否與多藥耐藥有關(guān)系，目的為開發(fā)治療抗腫瘤的新的有效藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20只SD大鼠，雌雄各半，體重(260±20)g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)SCXK黔2002-0001)。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 株人大腸癌細(xì)胞株HCT-8與耐長(zhǎng)春新堿細(xì)胞株HCT-8/V，購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 材料 乙醇(CAS號(hào)：64-17-5，東莞市喬科化學(xué)試劑制造有限公司)；人參、鴉膽、薏苡仁、莪術(shù)、喜樹果均購(gòu)置貴陽(yáng)南明區(qū)各大藥房；胎牛血清(CAS號(hào)：10270-106，杭州四季青生物材料研究所)；RIPA組織裂解液(批號(hào)：R0010，F(xiàn)ermentas)；BCA蛋白定量(批號(hào)：PC0020，上海博彩生物科技)；Anti-Bax(批號(hào)：ab32503，cell signaling)；Anti-Bcl-2(批號(hào)：ab182858，cell signaling)；Anti-mmp-2(批號(hào)：ab58803，cell signaling)；GAPDH(批號(hào)：E021010，cell signaling)

1.4 儀器 FA1004A電子分析天平(廣州衡祥電子有限公司)；TDL-40B臺(tái)式離心機(jī)(Anke)；PowerPac系列Western Blot的全套設(shè)備(美國(guó)Bio-Rad公司)；TS-1型脫色搖床(金壇市華城潤(rùn)華實(shí)驗(yàn)儀器廠)；Alpha Innotech凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Alpha公司)；InfiniteM200酶標(biāo)儀(Tecan Systems Inc.)

2 方法

2.1 含藥血清制備 將20只SD大鼠隨機(jī)分成兩組，正常動(dòng)物組和腸復(fù)康給藥組，雌雄各半，正常組動(dòng)物灌胃雙蒸水，給藥組灌胃腸復(fù)康16.5 mg/kg，每天1次，連續(xù)給藥7 d，最后一天給藥1 h后，在動(dòng)物清醒狀態(tài)下進(jìn)行股動(dòng)脈采血，血清室溫放置1 h，4000 r/min離心15 min，分離血清，將同組動(dòng)物血清歸總，55 ℃水浴30 min，滅活補(bǔ)體，-20 ℃保存[3]。

2.2 HCT-8/V細(xì)胞培養(yǎng) ①取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制備成1×105細(xì)胞懸液，接種于25 cm2培養(yǎng)皿置 37 ℃，5%CO2的孵育24 h。②加藥，分別設(shè)置HCT-8/V加20%胎牛血清，HCT-8/V加20%大鼠空白血清，HCT-8/V加20%含藥血清組，每組各3瓶，放置37 ℃，5%CO2的孵箱中繼續(xù)孵育72 h。

2.3 提取蛋白質(zhì)和定量 用RIPA裂解液+1%蛋白酶抑制劑在勻漿器中裂解細(xì)胞，在酶標(biāo)儀上測(cè)量蛋白濃度，-80 ℃分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 Western Blot法檢測(cè)多藥耐藥蛋白P-gp、LRP、MRP1、COX-2表達(dá)的影響 通過制膠，跑電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，孵一抗4度過夜，洗膜3次，孵二抗1 h后顯影曝光等步驟得出相應(yīng)的蛋白表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 腸復(fù)康對(duì)HCT-8/V細(xì)胞耐藥基因蛋白表達(dá)的影響 Western Blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腸復(fù)康含藥學(xué)期作用于HCT-8/V細(xì)胞后，P-gp蛋白的組1與組2相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)，3組與1組相比，P-gp蛋白表達(dá)(0.32±0.04)%明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.01)(見表2，圖1)；LRP蛋白的組1與組2相比，表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)，LRP蛋白表達(dá)(0.077±0.01)%明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.01)(見表2，圖1)；MRP1蛋白組1與組2相比，表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)，3組與1組相比，MRP1蛋白表達(dá)(0.36±0.05)%明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.01)(見表2，圖1)；COX-2蛋白組1與組2相比，表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)，3組與1組相比，COX-2蛋白表達(dá)(0.31±0.01)%明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.01)(見表2，圖1)。結(jié)果顯示腸服康可以顯著降低P-gp、LRP、MRP1、COX-2。

表2 腸復(fù)康對(duì)HCT-8/VCR細(xì)胞耐藥基因表達(dá)的影響

注：1.表示HCT-8/VCR +20%胎牛血清，2.HCT-8/VCR+20%大鼠空白血清，3. HCT-8/VCR +20%含藥血清。1組與2組比較，*P﹥0.05；1組與3組比較，#P﹤0.01。

3 討論

大腸癌是人們?nèi)粘Ｉ钪凶畛Ｒ姷膼盒阅[瘤之一[4]，而且發(fā)病率在常見病中日益增長(zhǎng)，臨床上普遍采用的的治療方法仍舊是放療與化療兩種，但是在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，也能夠殺死正常細(xì)胞。近年來(lái)，中醫(yī)藥在保持原有中醫(yī)特色治療大腸癌的同時(shí)，利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)對(duì)中醫(yī)抗大腸癌的作用機(jī)制作出了很多的探究，特別是在對(duì)腫瘤多藥耐藥的治療取得了一定程度的進(jìn)展。

P-gp在大腸癌中表達(dá)水平最高，在一些病理狀況下，P-gp會(huì)出現(xiàn)異常的高表達(dá)狀態(tài)。多種惡性腫瘤組織中均有P-gp水平的上調(diào)[5-6]，而惡性腫瘤細(xì)胞中過量的P-gp糖蛋白表達(dá)，促使一些具有親脂特性的化療藥物通過ATP能量泵使其從腫瘤細(xì)胞中被泵出，介導(dǎo)腫瘤的多藥耐藥[7]；肺蛋白酶(LRP)存在于各種人的正常細(xì)胞組織和惡性腫瘤細(xì)胞中，在惡性腫瘤細(xì)胞中抗癌藥物被清除或者毒性下降[8]；多藥耐藥相關(guān)蛋白l(MRPl)在人類組織器官中普遍存在，并且MRPl被稱作為“藥物外排泵”，因?yàn)镸RPl具有改變藥物在細(xì)胞內(nèi)部的形態(tài)分布，從而能夠?qū)е孪嚓P(guān)耐藥性的產(chǎn)生，賦予細(xì)胞耐藥的表型。MRP1可能是提示預(yù)后的分子標(biāo)志物，并有助于選擇合理化療藥物[9-10]；環(huán)氧化酶(Cyclooxygenases，COXs)是一種限速酶。目前只發(fā)現(xiàn)于某些細(xì)胞，COX-2的高表達(dá)可在大腸癌局部形成免疫抑制[11]。經(jīng)過大腸癌組織中COX-2蛋白的表達(dá)檢測(cè)，表明其對(duì)治療大腸癌以及對(duì)其預(yù)后的評(píng)判有積極作用。

綜上，腸復(fù)康的作用機(jī)理可能與相關(guān)蛋白P-gp、LRP、MRP1及COX-2的表達(dá)有相關(guān)性，并且在相當(dāng)程度上具有逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用。另外，因?yàn)榭诜兴帉?duì)比起來(lái)副作用較小，并且價(jià)格相對(duì)低廉而作用積極，普遍被患者所接受，而隨著中藥在腫瘤多靶點(diǎn)治療以及在多藥耐藥機(jī)制方面的不斷探索，中藥治療大腸癌必定會(huì)成為一種新的主要治療方法，為抗腫瘤的有效治療開創(chuàng)新的前景。