雙啟動子調控β-半乳糖苷酶基因表達載體的構建及表征分析

趙海麗 呂素芳

摘要： 本試驗的目的是擴增得到β-半乳糖苷酶基因啟動子序列和β-半乳糖苷酶基因并反向插入pET32a載體中，構建穿梭質粒表達載體，并進行誘導表達，分析β-半乳糖苷酶基因在雙啟動子序列調控下的表達特征。

關鍵詞： 大腸桿菌;β-半乳糖苷酶基因;表達載體

中圖分類號： Q756?? ?文獻標識碼： A?? ?文章編號： 1672-9129（2018）09-0078-01

Abstract： ?the purpose of this study was to obtain the expression characteristics of the lion-galactosidase gene promoter sequence and the lion-galactosidase gene through the reverse insertion of the pET32a vector， construct the shuttle plasmid expression vector， and conduct the induced expression， and analyze the expression characteristics of the lion-galactosidase gene under the regulation of the double promoter sequence.

Keywords： escherichia coli;β-Galactosidase gene;Expression vector

β-半乳糖苷酶，又稱β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，廣泛存在于各種動物﹑植物及微生物中。β-半乳糖苷酶能催化β-半乳糖苷化合物中的β-半乳糖苷鍵發生水解，還具有轉半乳糖苷的作用。由于它具有糖苷鍵結構特異性，可作為乳糖降解和雙糖合成催化劑，并具有水解生物體內儲存的多糖和半乳糖殘基，引起血型轉化等生理功能[1]，而受到人們廣泛關注，成為生物化學和酶催化化學的重要研究課題。β-半乳糖苷酶的應用有著悠久的歷史，最初在食品工業中用來降解乳糖含量以滿足乳糖不耐癥癥狀患者的需要，隨著生物技術的發展，它越來越多的應用于生物技術、化學、醫藥等領域。

1 材料與方法

1.1實驗材料。

（1）菌株和克隆載體 豬大腸桿菌987P（登記號C83710）菌種，pET32a 載體。

（2）工具酶與試劑盒 各種限制性內切酶（NheⅠ、XbaⅠ）、dNTP、PCR Buffer 、Taq DNA聚合酶、RNAase、 DL15000、DL2000、IPTG均購自TaKaRa生物公司;DNA回收試劑盒購自大連寶生物工程（大連）有限公司。其他生化試劑均為化學分析純。

1.2實驗方法

（1）總DNA的快速提取 挑取單菌落到1.5ml離心管內，加20μl雙蒸水后混勻，95℃水浴10min，-20℃10min，于4℃、12000rpm離心2min，取上清備用。

（2）β-半乳糖苷酶基因的PCR擴增 反應體系：模板1 μl，10×PCR buffer2.5μl，dNTP 3μl，上、下游引物各1μl，Taq DNA聚合酶 0.5μl，ddH2O 16μl。反應條件為95℃預變性4 min，94℃變性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸3 min，35個循環，最后延伸10min。取5μl PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

（3） PCR產物及pET32a雙酶切、回收、連接、轉化及鑒定：參照分子克隆。

（4） 重組表達載體的誘導及SDS-PAGE檢測：常規操作。

（5）表達產物的劃線鑒定 利用涂布36μL 20mg/ml X-gal，34μL 24mg/ml IPTG LB固體選擇培養基和涂布36μL 20mg/ml X-gal固體選擇培養基進行。

2 結果與分析

2.1 β-半乳糖酶苷基因的PCR 挑取987P細菌進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后在3064bp處有明亮條帶，為目的條帶，說明擴增成功。大量擴增后進行酶切回收。

2.2 重組質粒的菌落PCR鑒定及雙酶切鑒定 經連接轉化后，隨機挑取白色菌落進行PCR擴增。結果均擴增出3064bp大小目的片段，選取兩個菌落進行大量培養，提取質粒進行Nhe Ⅰ、Xba Ⅰ雙酶切后，出現一條5900bp載體片段和一條3064bp目的片段，均為陽性重組子，表明重組質粒構建成功，可以進行誘導表達。

2.3 重組表達載體的誘導 選取陽性重組質粒進行活化培養，按1/100接種于LB液體培養基培養，對數期時加入IPTG誘導，在不同時期取樣進行電泳檢測，結果證明表達成功，在120 KD左右為目的蛋白，誘導時間不同對于β-半乳糖苷酶表達量影響不大。

2.4 表達產物的劃線鑒定 將陽性重組質粒培養液劃線接種于涂布X-gal， IPTGLB固體選擇培養基和涂布X-gal固體選擇培養基，設空白對照，37℃溫箱中培養過夜，得到菌株;在含有X-gal和誘導物IPTG（A）的培養基上菌株形成明顯的藍色菌落;在只含有X-gal的培養基（B）中形成不明顯的藍色菌落。結果表明：陽性菌株均能在含有IPTG誘導物的情況下高效表達β-半乳糖苷酶，在不存在IPTG誘導物的情況下三株野生菌株只產生少量的β-半乳糖苷酶。

3 討論

目前分子生物學與基因克隆工作中，常以耐藥性基因作為克隆篩選的標記，其優點是可以對克隆轉化子進行正向篩選，而且可使含耐藥性基因的質粒在抗生素存在的情況下保持穩定。然而其缺點是顯而易見的，在農業和食品工業中應用的菌株，如果含有位于質粒上的耐藥性基因，有可能造成耐藥性基因的擴散，而以非抗生素抗性為選擇標記的載體系統可以克服以上不足[3]。β-半乳糖酶基因是細菌的持家基因和營養因子，所以β-半乳糖苷酶基因也可以作為質粒載體穩定表達的選擇標記，這在減少畜產品中的藥物殘留以及保護微生態環境均具有重要的意義。這樣不但賦予了β-半乳糖酶基因的新用途，更使質粒達到了“食品級”的要求，從而更加廣泛的應用于畜牧生產與人類保健。

參考文獻：

[1]王春鳳，秦澤榮，孫哲，等.以ThyA基因為選擇壓力非抗性質粒載體的構建.微生物學通報.2001，28（2）：42—46

[3]孫哲，王春鳳，汪明.大腸桿菌β-半乳糖酶苷基因缺陷型菌珠的篩選.中國獸醫雜志.2004.40（2）：12—14