羽扇豆醇對腦缺血再灌注大鼠氧化應激損傷和炎性反應的調節作用及機制研究

侯 辰，唐 鵬，劉 玥，張 欣，陳 麗，張李娜

腦缺血再灌注(IR)損傷是一種嚴重的臨床問題，其原因包括心臟驟停、周圍血管功能不全和卒中[1]。損傷機制在缺血期間被觸發，在再灌注期間加重[2]。IR的損傷機制包括氧化應激、細胞凋亡和線粒體功能損傷[3]。在缺血過程中，細胞膜改變導致鈣超載，從而激活細胞內鈣依賴的級聯反應，誘導促炎細胞因子，抑制抗炎細胞因子，并且促進次黃嘌呤和自由基的產生。在再灌注后期，過量的氧與次黃嘌呤發生反應，導致多種有毒過氧化物的形成。這些強效氧化劑會導致DNA損傷，以及蛋白質氧化，并通過脂質過氧化直接損傷細胞膜[4]。因此IR損傷過程中，氧化應激反應和炎性反應是最重要的病理過程[5]。羽扇豆醇是一種三萜類天然產物，幾種常見的果蔬中都含有羽扇豆醇，如草莓、卷心菜、芒果、葡萄、青椒和橄欖等[6]。研究表明，羽扇豆醇對炎癥、癌癥、關節炎、糖尿病、心臟病、腎毒性和肝毒性都有改善的作用[7]。本研究旨在探討羽扇豆醇對IR大鼠氧化應激損傷和炎性反應的調節作用和機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物及主要試劑 120只成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠來源于中國科學院實驗動物中心，體重250～280 g。動物被安置在特定的無菌環境中：溫度22℃左右，相對濕度55%～60%，12 h晝夜交替，大鼠能自由獲取食物和飲用水。Tunel試劑盒(In Situ Cell Death Detection Kit)購自羅氏(Roche)；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自R&D公司。抗Bcl-2(ab196495)和Bax(ab32503)抗體購自Abcam公司。蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒購自Solarbio公司，貨號：G1120。

1.2動物分組及模型制備 120只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、不同濃度羽扇豆醇組。模型組和不同濃度組采用改良線栓法制備大鼠IR損傷模型：用2%異氟醚麻醉大鼠，用尼龍線結扎大鼠頸總動脈，線栓向上推行至大腦中動脈，造成大腦中動脈梗阻，缺血2 h后，拔退線栓，恢復大腦供血，縫合消毒，待大鼠醒后，按Longa標準篩選IR模型[8]，符合評分標準的模型進入后續實驗。假手術組：大鼠麻醉后進行開刀和縫合手術，不進行動脈結扎。不同濃度羽扇豆醇組分別給予羽扇豆醇10、20、50 mg/kg腹腔注射，模型組和假手術組均給予相同濃度的DMSO生理鹽水腹腔注射。

1.3標本采集 5組大鼠連續注射1周藥物或溶劑后收集血清待測，頸椎脫臼法處死，取腦組織制成石蠟切片(固定-脫水-包埋-切片)用于后續切片染色；并收集各組腦組織液氮冷凍，-80℃冰箱冷藏待檢測。

1.4HE染色 將5組大鼠腦組織石蠟切片用二甲苯浸洗2次，每次5 min；用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)各浸洗1次，每次3 min；給予HE染色，在顯微鏡下觀察組織病變情況并拍照。

1.5TUNEL染色 二甲苯脫蠟，每次5 min；梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)復水，每次3 min；在25℃條件下，Proteinase K工作液消化組織15 min；PBS漂洗；按照說明書進行TUNEL染色，漂洗；玻片干后加50 μl converter-POD于標本上，加蓋玻片在暗濕盒中37℃條件下反應30 min，漂洗；在組織處加50 μl DAB底物，在25℃條件下反應10 min，漂洗；拍照，然后用蘇木素復染3～5 s，立即用自來水沖洗。梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。加一滴PBS在視野下，用光學顯微鏡觀察凋亡細胞并拍照。

1.6蛋白免疫印跡法檢測腦組織線粒體損傷標記蛋白表達水平 液氮研磨腦組織，提取組織中總蛋白；取等量蛋白與適量Loading buffer混合，100℃金屬浴10 min；上樣到SDS-PAGE凝膠電泳中分離蛋白，并轉移至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1～2 h；加入抗Bax和抗Bcl-2一抗，4℃過夜孵育，次日，TBST清洗后再加標記HRP的二抗，室溫孵育1 h，清洗。最后加入發光液，于凝膠成像儀進行曝光拍照，并用ImageJ軟件統計灰度值計算相對表達量。GAPDH作為上樣量一致的參照，至少進行3個獨立的重復實驗。

1.7ELISA檢測血清中氧化應激標志物水平和血清炎性因子水平 取5組大鼠血清，檢測超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)水平和白介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF-α)水平。按照說明書，加入稀釋好的標準品50 μl于反應孔，加入待測樣品50 μl于反應孔內，設計好復孔和陰性對照；立即加入50 μl的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1 h；甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干，重復此操作4次；每孔加入80 μl的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30 min，洗滌方法同上；每孔加入底物A、B各50 μl，輕輕振蕩混勻，37℃避光溫育10 min；取出酶標板，迅速加入50 μl終止液，加入終止液后應立即測定結果：在450 nm波長處測定各孔的吸光度(OD)值。

2 結果

2.1IR損傷改善情況 模型組相較于假手術組病理改變非常明顯，提示大鼠模型制備成功；與模型組比較，不同濃度羽扇豆醇組腦組織損傷程度隨加藥濃度增加而明顯減輕，腦組織間隙的空泡變少，并且出現核邊集、固縮的神經元也明顯減少。見圖1。

2.2腦組織細胞凋亡率 與假手術組比較，模型組細胞形態特征呈現出未染色細胞變小，胞膜完整，出現空泡；而染色細胞呈現染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質分割成塊狀；不同濃度羽扇豆醇組細胞形態隨藥物濃度增加逐漸趨近于假手術組。見圖2。假手術組、模型組、羽扇豆醇10 mg/kg組、羽扇豆醇20 mg/kg組和羽扇豆醇50 mg/kg組細胞凋亡率分別為(5.1±0.5)%、(58.2±8.1)%、(39.3±8.9)%、(24.2±7.1)%、(13.3±5.2)%。模型組細胞凋亡率高于假手術組(P<0.01)；不同濃度羽扇豆醇組細胞凋亡率低于模型組，且呈劑量依賴性(P<0.01)。

圖1 5組大鼠腦組織病理變化情況(HE×400)

圖2 5組大鼠腦組織細胞凋亡情況(TUNNEL×400)

2.3線粒體損傷標記蛋白表達情況 與假手術組比較，模型組Bax表達水平升高，Bcl-2表達水平降低(P<0.01)。與模型組比較，不同濃度羽扇豆醇組Bcl-2表達水平升高，Bax表達水平降低，且呈劑量依賴性(P<0.01)。見圖3、表1。

圖3 5組大鼠腦組織線粒體損傷標記蛋白表達水平

組別鼠數Bcl-2Bax假手術組241.40±0.100.12±0.05模型組240.15±0.01b1.60±0.13b羽扇豆醇10 mg/kg組240.30±0.06d1.20±0.14d羽扇豆醇20 mg/kg組240.64±0.07df0.40±0.07df羽扇豆醇50 mg/kg組241.15±0.10dfh0.20±0.05dfh

注：與假手術組比較，bP<0.01；與模型組比較，dP<0.01；與羽扇豆醇10 mg/kg組比較，fP<0.01；與羽扇豆醇20 mg/kg組比較，hP<0.01

2.4氧化應激損傷情況 與假手術組比較，模型組血清中SOD和GSH水平降低，MDA水平升高(P<0.01)。與模型組比較，不同濃度羽扇豆醇組血清中SOD和GSH水平升高，MDA水平降低，且呈劑量依賴性(P<0.01)。見表2。

表2 5組大鼠血清氧化應激標志物水平變化情況

注：與假手術組比較，bP<0.01；與模型組比較，dP<0.01；與羽扇豆醇10 mg/kg組比較，fP<0.01；與羽扇豆醇20 mg/kg組比較，hP<0.01

2.5炎性反應 與假手術組比較，模型組IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高(P<0.01)；與模型組比較，不同濃度羽扇豆醇組IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低，且呈劑量依賴性(P<0.01)。見表3。

表3 5組大鼠血清炎性因子水平變化情況

注：與假手術組比較，bP<0.01；與模型組比較，dP<0.01；與羽扇豆醇10 mg/kg組比較，fP<0.01；與羽扇豆醇20 mg/kg組比較，hP<0.01

3 討論

IR損傷過程中常伴隨缺血腦組織神經元細胞凋亡，這是通過激活caspase依賴性凋亡信號通路介導的[3，9]。Bax加速細胞凋亡過程，而Bcl-2抑制細胞凋亡。Bax/Bcl-2平衡失調會造成線粒體損傷[10]。在缺血區域，Bax水平升高，而Bcl-2水平下降，導致線粒體中細胞色素C的釋放，從而引發腦缺血后細胞凋亡[11]。本研究結果顯示，模型組腦組織細胞凋亡率高于假手術組，且Bax水平升高，Bcl-2水平下降，與上述文獻報道結果一致。用不同濃度羽扇豆醇處理后，Bax水平隨藥物濃度增加而降低，Bcl-2水平隨藥物濃度增加而升高。提示羽扇豆醇能降低大鼠IR損傷模型細胞凋亡，減少線粒體損傷。

有大量的證據證明氧化應激在缺血再灌注誘導的大腦氧化應激的發病機制中的作用[5,12]。活性氧和脂質過氧化物在氧化應激損傷中起關鍵作用[13-14]。機體在對抗氧化應激時，SOD、GSH能抵消部分過氧化物，局部缺血時，這些物質幾乎消耗殆盡；而脂質過氧化產物MDA水平則大幅提高。羽扇豆醇的抗氧化應激能力早有報道。Sunitha等[15]發現羽扇豆醇通過清除自由基提高大鼠肝臟的抗氧化作用，從而改變鎘暴露誘導的組織氧化還原系統的影響。Prasad等[16]發現補充羽扇豆醇可以有效地降低肝臟二甲丁醇酸誘導的氧化應激，恢復抗氧化酶活性，降低脂質過氧化作用。Yamashita等[17]研究表明，Lupeol能抑制fMLP處理的人中性粒細胞中花生四烯酸誘導的過氧化物。Lupeol已被證明可以抑制活性氧生成，并能恢復在雄激素預處理小鼠的前列腺組織中衰竭的抗氧化水平[18]。本研究結果顯示，模型組SOD和GSH水平低于假手術組，MDA水平高于假手術組；用不同濃度羽扇豆醇處理后，血清SOD和GSH水平升高，MDA水平降低，與上述研究結果一致。提示羽扇豆醇能增加抗氧化物酶活性，有效減少氧化應激損傷。

近年來，大量研究表明炎性反應在IR損傷中起著關鍵作用[19-20]。大量炎性細胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)參與IR損傷后的腦細胞凋亡和壞死[21]，及腦缺血引起的炎性反應[22]。有研究報道，減少炎性因子可以保護大腦不受IR的影響[23]。研究發現，羽扇豆醇的抗炎作用相當于地塞米松[24]，可以通過抑制IL-1β、IL-6和TNF-α達到抗炎的效果[25]。Fernández等[2]研究表明，對耳鼠局部給藥可以減輕TPA誘導的炎性反應，羽扇豆醇局部應用可降低髓過氧化物酶(中性粒細胞特異性標記)水平，從而減少小鼠細胞向炎性組織浸潤，可減少脂多糖處理的巨噬細胞中TNF-α和IL-β等促炎性因子的生成。有研究在支氣管哮喘小鼠模型中，觀察到羽扇豆醇通過降低Ⅱ型細胞因子IL-4、IL-5和IL-13的水平而緩解炎癥[24]，還可促進M1巨噬細胞轉化為M2，并改善實驗性炎癥性腸病[26]。本研究結果表明，與假手術組比較，模型組炎性細胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)顯著增加，與模型組相比，不同濃度羽扇豆醇組IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低，與上述研究結果一致。提示羽扇豆醇能減少促炎性細胞因子，降低IR炎性反應。

綜上所述，羽扇豆醇可抑制IR損傷引起的細胞凋亡，降低IR氧化應激損傷和炎性反應。已知文獻報道了其他藥物通過激活JAK-STAT減少細胞凋亡，改善IR損傷[27]，以后可以檢測相關通路蛋白表達水平，進一步探索羽扇豆醇改善IR損傷分子機制。