依達拉奉聯合雷帕霉素對蛛網膜下腔出血大鼠神經細胞自噬及學習記憶的影響

安朝旺 王 崢 李建民 趙雅寧 付愛軍 黃海玲

(華北理工大學附屬醫院神經外科，河北 唐山 063000)

研究發現自噬參與蛛網膜下腔出血(SAH)的早期腦損傷(EBI)病理進程，決定EBI階段神經細胞的轉歸：恢復或修復、加重或死亡〔1〕。雷帕霉素(RAP)是一種新型的大環內酯類免疫抑制劑，可特異性抑制雷帕霉素靶蛋白(mTOR)激活，調控基因的轉錄和蛋白的表達，進而影響細胞自噬進程〔2〕。依達拉奉是2001年上市的氧自由基清除劑，被廣泛應用于腦梗死、急性腦出血等疾病的救治〔3，4〕。目前有關RAP 和依達拉奉對SAH保護機制的研究不多。本研究建立SAH動物模型，應用依達拉奉聯合RAP進行干預，觀察自噬關鍵因子Beclin-1和微管相關蛋白1(輕鏈LC3)-Ⅱ表達及動物學習記憶恢復情況，分析RAP和依達拉奉對SAH神經保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1動物分組與模型制作 清潔級雄性SD大鼠80只，體重350～450 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司〔動物合格證號為SCXK(京)2009-003〕，分為假手術組、SAH組、RAP組和依達拉奉聯合RAP組(聯合組)。每組分為24 h、48 h、72 h 和144 h四個時間亞組。模型制作〔5〕采用經典的二次注血法(向枕大池注射自體動脈血0.3 ml，二次間隔時間為48 h)制備大鼠蛛網膜下腔出血的模型。假手術組向枕大池兩次注入0.3 ml生理鹽水，余操作均與SAH組一致。模型成功判定標準：①當進行二次枕大池注血時，可見少量血性腦脊液在穿刺部位滲出；②剝離腦部時肉眼顯見血性液體散在分布在腦底基底池部位。RAP組：SAH模型制備成功后即刻經腹腔注射100 μg/kg，每24 h給藥1次；聯合組在RAP組基礎上經尾靜脈注射依達拉奉，10 mg/kg，每24 h給藥1次。

1.2動物學習記憶檢測 分別傷后第72小時和144小時采用Morris水迷宮進行檢測，上午、下午各1次，記錄各組搜索安全島潛伏期時間和撤掉平臺后大鼠穿越原平臺位置的次數，取檢測記錄的總均值。

1.3腦組織海馬區形態結構觀察 每組各時間點取5只大鼠，常規麻醉后，處死動物，用4%多聚甲醛灌注固定后，石蠟包埋、冠狀切片，HE染色，400倍光學顯微鏡下觀察海馬區神經細胞形態結構。計數每個視野存活神經細胞數量，具體方法：每只大鼠取4張海馬區切片，每張切片選取5個不重復的視野(共100個視野)，選Motic-6.0圖像采集及分析系統分析，以每個視野下平均細胞百分率(400×)下CA1區存活細胞數量與總細胞數量比值表示。

1.4免疫組織化學法檢測Beclin-1和LC3-Ⅱ陽性表達 腦組織標本采集方法同HE染色，腦組織切片常規脫蠟至水，37 ℃溫箱中孵育20 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3 次，每次5 min，用3%H2O2封閉15 min，PBS洗滌3×5 min，滴加兔抗鼠Beclin-1和LC3-Ⅱ多克隆抗體(1∶200，1∶200，1∶250)，4℃過夜；37℃復溫45 min，PBS洗滌3×5 min，滴加二抗，37 ℃溫箱中孵育40 min，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素輕度復染、脫水透明、封片。鏡下觀察并攝片。陽性率的定量分析：每個標本取4張切片，將每張切片的CA1區平均分為3個等份，每個等份選取一個相同部位的4個視野，應用Motic-6.0圖像采集及圖像分析系統分析各組陽性細胞進行吸光度。

1.5統計學處理 應用SPSS17.0 統計分析軟件進行方差分析及SNK-q分析。

2 結 果

2.1各組學習記憶能力 與假手術組比較，SAH組各時間點逃避潛伏期明顯延長、穿臺次數明顯減少；與SAH組比較，RAP組各時間點逃避潛伏期時間明顯縮短、穿臺次數增多；與RAP組比較，聯合組逃避潛伏期時間明顯縮短、穿臺次數明顯增多(均P<0.05)。見表1。

2.2各組海馬區神經元形態學變化 假手術組海馬區神經細胞結構正常、排列整齊。SAH組海馬區可見較多壞死神經細胞，表現為細胞核溶解、核碎裂，或細胞正常結構消失；與假手術組比較，SAH組各時間點神經細胞存活率均明顯減少(P<0.05)。RAP組神經細胞形態結構損傷減輕，與SAH組比較，視野中存活神經細胞明顯增多(P<0.05)；聯合組神經細胞形態結構損傷進一步減輕，各時間點神經元存活率均明顯增多(P<0.05)。見圖1、表2。

2.3各組海馬區Beclin-1和LC3-Ⅱ免疫組織化學檢測結果 Beclin-1和LC3-Ⅱ陽性表達主要位于細胞核。假手術組海馬區有少量的陽性細胞，染色較淡；與假手術組比較，SAH 組Beclin-1和LC3-Ⅱ陽性細胞染色棕黃，免疫陽性反應明顯增強(P<0.05)；與SAH組比較，RAP組Beclin-1和LC3-Ⅱ陽性細胞染色棕黃，免疫陽性反應明顯增強(P<0.05)；聯合組神Beclin-1和LC3-Ⅱ免疫陽性反應進一步增強(P<0.05)。見表3、表4、圖2。

表1 各組逃避潛伏期和穿臺次數比較

與假手術組比較：1)P<0.05；與SAH比較：2)P<0.05；與RAP組比較：3)P<0.05，下表同

圖1 各組大鼠72 h海馬區組織病理形態的變化(HE，×400)

表2 各組海馬區神經細胞存活率比較

圖2 各組72 h海馬區Beclin-1和LC3-Ⅱ免疫組織化學結果(DAB,×400)

表3 各組海馬區Beclin-1相對表達量比較

表4 各組海馬區LC3-Ⅱ相對表達量比較

3 討 論

本研究發現RAP可減少SAH大鼠海馬區神經細胞死亡，降低動物學習記憶障礙，提示RAP對SAH的EBI有一定保護作用。RAP具有抗炎、免疫調節作用，臨床上主要用來協助器官移植術后的抗免疫治療〔6，7〕。近年研究顯示RAP具有一定的神經保護作用，可阻斷細胞內復合物1的活性導致ATP的損耗和細胞內氧自由基生成過多，拮抗神經退行性病變如帕金森病、阿爾茨海默病進程中神經細胞的凋亡〔8，9〕。動物實驗證實RAP可通過作用于其靶蛋白mTOR抑制其活性，進而調控細胞周期、減少能量的耗損，降低促凋亡蛋白表達，以促進應激狀態下細胞的存活〔10〕。RAP通過抑制mTOR激活，促進自噬已被證實〔11〕。腦損傷狀態下，自噬激活能清除細胞內受損細胞器、調節細胞能量代謝、減輕細胞損傷程度；但自噬過度可以促進Caspase-3裂解，加重神經細胞死亡〔12〕。本研究中RAP組自噬標記蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ表達增加，此時神經細胞存活率增加，動物學習記憶損傷情況，一方面說明SAH的EBI階段自噬激活具有神經保護作用，也說明RAP通過增強EBI階段的自噬程度而發揮對SAH的神經保護作用。

本研究發現依達拉奉對SAH有很好的保護作用。SAH后顱內血液積聚、凝固血塊壓迫造成缺血缺氧、積聚的血紅細胞裂解使氧合血紅蛋白進一步釋放超氧陰離子和生成羥基自由基，使氧自由基生成增加等，誘導強烈氧化應激反應，神經細胞損傷加重〔13，14〕。神經保護劑依達拉奉主要通過清除氧自由基、減輕氧化應激導致的一系列級聯反應而防治腦損傷的持續進展，這是本研究中聯合組中存活神經細胞數量、動物學習記憶情況均進一步改善的主要原因。本研究中聯合組Beclin-1和LC3-Ⅱ表達增加進一步增高，提示依達拉奉可強化RAP對SAH后自噬活性的調控。研究發現氧自由基可激活自噬，且與mTOR途徑〔15〕；而依達拉奉可清除大量的氧自由基，使機體氧自由基水平保持在一定水平，從而維持SAH后自噬水平適度表達〔16〕。