VEGF基因沉默脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)人MKN45胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

安 琳 蘇慎勇 張 祎

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河北 保定 071000)

腫瘤細(xì)胞可以無(wú)限增殖至今仍是不能被人類所克服的疾病〔1～3〕。腫瘤無(wú)限增殖需要很多的條件，最為關(guān)鍵的一點(diǎn)即需要大量的血供，那么，腫瘤中的血管在腫瘤增殖轉(zhuǎn)移中起著極為重要的意義，這一點(diǎn)也成為我們攻克腫瘤的一個(gè)著手點(diǎn)，如果可以減少腫瘤中血管的數(shù)量，就可以很大程度上抑制腫瘤的生長(zhǎng)。腫瘤細(xì)胞要自我增殖，其自身可以通過(guò)多種機(jī)制使得其周圍環(huán)境有益于其生長(zhǎng)，其中當(dāng)然包括最為重要的誘導(dǎo)的血管生成，這一過(guò)程是一個(gè)由多因素參與極為復(fù)雜的過(guò)程，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)則是眾多因素中較為重要的一個(gè)，在血管生成中發(fā)揮著非常重要的作用〔4～7〕。研究發(fā)現(xiàn)VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的影響血管生成作用最強(qiáng)誘導(dǎo)因子，大量實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)其可以通過(guò)促進(jìn)腫瘤血管的生成而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及轉(zhuǎn)移〔8～11〕。它可以通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤血管的生成，從而為腫瘤生長(zhǎng)創(chuàng)造了有利的條件，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移〔12〕。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在一定條件下腫瘤細(xì)胞可以自己分泌大量VEGF，促進(jìn)腫瘤血管形成，為自己生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件，血液中VEGF大部分是由于腫瘤細(xì)胞自己分泌的，故我們可以通過(guò)測(cè)定腫瘤患者血液中VEGF含量，依此來(lái)判斷腫瘤生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)狀況及腫瘤的生長(zhǎng)情況，為尋找更有效的治療方案提供一定的依據(jù)。 因此，有望通過(guò)抑制VEGF基因的表達(dá)，破壞腫瘤生長(zhǎng)的有利環(huán)境，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移〔13,14〕。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)是干細(xì)胞的一種，因此具有與干細(xì)胞相似的特性，相關(guān)研究將其用于各種疾病的治療，但是使ADSCs內(nèi)VEGF基因沉默后觀察其對(duì)腫瘤的影響研究尚少，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將ADSCs中的VEGF基因沉默后觀察其對(duì)人MKN45胃癌細(xì)胞系體內(nèi)生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1設(shè)計(jì)、時(shí)間及地點(diǎn) 隨機(jī)對(duì)照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于2014年1月至2015年12月在河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心完成。

1.2實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)GenBank中的VEGF基因序列及siRNA的設(shè)計(jì)原則，合成VEGF基因siRNA靶序列(5'-GATCCCCTCATCACGAAGTGGTGAAGttcaagagaCT-TCACCACTTCGTGATGATTTTTGGAAA-3')和一條陰性對(duì)照序列(即無(wú)關(guān)序列:5'-GATCCCCGTGAGATCGTAGTGCGTG-Attcaagaga-TCACGCACTACGATCTCACT-TTTTGGAAA-3')及其互補(bǔ)的反義鏈。采用Blaster軟件進(jìn)行比對(duì)，并因此確定siRNA對(duì)靶基因的特異性。將分別與靶序列及陰性對(duì)照序列互補(bǔ)的兩條鏈經(jīng)退火反應(yīng)后形成雙鏈DNA，依此作為模板鏈。用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶將pSUPER.retro.neo載體雙酶切形成線性化載體，將酶切反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳，然后將線性載體進(jìn)行回收。然后用相應(yīng)連接酶將線性載體進(jìn)行連接，將模板鏈進(jìn)行重組，形成重組載體，靶序列和陰性對(duì)照序列的重組載體分別命名為pSUPER-siRNA-VEGF載體和pSUPER-siRNA-N載體。也因此將其分為VEGF siRNA組，陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組〔15〕。

1.3材料及來(lái)源 RNA干擾試劑盒(美國(guó)Ambion公司)、人VEGF定量酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒、 Lipofectamine2000(Invitrogen生命技術(shù)公司)、RT-PCR所需引物及試劑 (Takara公司，日本)、Trizol試劑盒(杭州水然科技有限公司)、生物素標(biāo)記的鼠抗人CD 34單克隆抗體(上海科順生物科技有限 公司)、顯微鏡(德國(guó)Leica公司)、紫外分光光度計(jì)購(gòu)于上海奧析原、細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)買自Heraeus Sepatech 公司、血糖儀從美國(guó)Johnson & Johnson公司提供、DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)、細(xì)胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿購(gòu)于上海百研生物科技有限公司，二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)于上海人和科技有限公司。

1.4方法

1.4.1基因siRNA沉默 根據(jù)GenBank中VEGF基因序列及siRNA的設(shè)計(jì)原則，從siRNA中選取僅于VEGF具有特異性的相關(guān)的序列，而與其他序列卻一點(diǎn)都不能匹配的序列，siRNA1：5'-AUGUGAAUGCAGACCAAAGAATT-3',siRNA2:5'-GGCCAGCACATAGGAGAGA-3'，陰性對(duì)照序列：5'-GAUAGCAAUCACGAAGCGUATT-3'〔16〕。

1.4.2基因Lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染 根據(jù)轉(zhuǎn)染反應(yīng)相關(guān)說(shuō)明書的書寫要求進(jìn)行操作，所有操作開始前，首先取少量處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的MKN45胃癌細(xì)胞，將其置于6孔板中進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)選用的培養(yǎng)基不含抗生素，經(jīng)過(guò)24 h的培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)融合已達(dá)到80%～90%，然后向其中加入含有siRNA的轉(zhuǎn)染試劑，加入后使其與細(xì)胞在一起孵育5 h，5 h后進(jìn)行更換培養(yǎng)液，即倒出就得培養(yǎng)液同時(shí)加入新的繼續(xù)進(jìn)行孵育。分別在培養(yǎng)的24 h，48 h，72 h和96 h后收集少量轉(zhuǎn)染細(xì)胞，接種裸鼠皮下，觀察胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及用于以下實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次〔17〕。

1.4.3RT-PCR檢測(cè)VEGF的表達(dá) 采用RT-PCR的方法檢測(cè)siRNA 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中 VEGF的表達(dá)情況，具體操作步驟如下：首先用Trizol試劑盒將各組細(xì)胞中總的 RNA提取出來(lái)，并從中提取少許進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后分別與轉(zhuǎn)染后的24 h、48 h、72 h檢測(cè)各組細(xì)胞VEGF的表達(dá)情況。β-actin 作內(nèi)對(duì)照。PCR 反應(yīng)體系為 50 μl。VEGF 基因 PCR 引物:擴(kuò)增產(chǎn)物為 541 bp，正向 5'-GCCAACCTCAACTCAAGGAC-3'，反向 5'-AAGGAGCTGGATGAAGAGAC-3';β-actin 基因PCR 引 物:擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 為 291 bp，正 向 5'-ACCACAGCT-GAGAGGGAAATCG3'，反 向 5'-AGAGGTCCTTACGGATGTCAACG3'。針對(duì)抑制效果較好的序列，隨機(jī)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物序列，作為siRNA的陰性對(duì)照siRNA/C1、siRNA/C2。擴(kuò)增后取少許PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，并通過(guò)紫外照相進(jìn)行掃描分析，用Alpha E-ase FCTM軟件分析，siRNA處理24 h、48 h、72 h，VEGF的表達(dá)水平變化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次〔18〕。

1.4.4通過(guò)CD34免疫組織化學(xué)法染色檢測(cè)胃癌組織血管生成情況 將各組裸鼠處死后，取含有MKN45胃癌細(xì)胞的組織進(jìn)行消化，將消化后的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，取少許細(xì)胞懸液滴在事先準(zhǔn)備好的含有載玻片的6孔板上，滴加細(xì)胞懸液后置入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，待細(xì)胞融合數(shù)達(dá)80%時(shí)，進(jìn)行沖洗→固定→沖洗→封閉→加入抗體→沖洗→染色，經(jīng)過(guò)以上步驟后置于顯微鏡下，調(diào)整顯微鏡至低倍鏡下全面觀察切片，找到血管分布最密的區(qū)域，切片不動(dòng)，調(diào)整顯微鏡至高倍鏡下觀察并數(shù)出同一視野下的血管數(shù)目，同樣的方法分別選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，獲得5個(gè)視野內(nèi)血管數(shù)的平均值，依此值作為平均血管密度(MVD)值〔19〕。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0 軟件進(jìn)行χ2及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1RT-PCR檢測(cè)VEGF的表達(dá) 與陰性對(duì)照組(0.69±0.04)和空白對(duì)照組(0.66±0.03)比較，VEGF siRNA組VEGF表達(dá)顯著降低(0.33±0.02，P<0.05)，見圖1。

2.2基因轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)情況 陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的ADSCs在裸鼠體內(nèi)可顯著促進(jìn)MKN45胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，兩組的腫瘤重量分別為(1.84±0.12)g，(1.83±0.15)g，明顯高于VEGF siRNA組的腫瘤重量〔(1.11±0.14)g，P<0.05〕，而VEGF siRNA組ADSCs在裸鼠體內(nèi)對(duì)MKN45胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)促進(jìn)作用，與單純MKN45組腫瘤重量〔(1.12±0.15)g〕差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3各組MVD比較 陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組MVD分別為(10.9±0.64)個(gè)/視野，(10.7±0.50)個(gè)/視野，均明顯高于VEGFsiRNA組，〔(5.3±0.36)個(gè)/視野，P<0.05〕，單純MKN45組為(5.1±0.52)個(gè)/視野，與VEGF siRNA組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖1 RT-PCR檢測(cè)各組VEGF mRNA表達(dá)

圖2 各組CD34免疫組化表達(dá)(DAB，×200)

3 討 論

腫瘤雖有無(wú)限增殖及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特性，但是如果沒(méi)有支持其無(wú)限增殖及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的條件，其同樣不可能實(shí)現(xiàn)以上過(guò)程。其中對(duì)其增殖及轉(zhuǎn)移最為重要的條件即為營(yíng)養(yǎng)支持。而腫瘤中形成血管是為其自身提供營(yíng)養(yǎng)支持的最重要的過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)這個(gè)過(guò)程是一個(gè)由許多生長(zhǎng)因子調(diào)控的非常復(fù)雜的過(guò)程，而VEGF是這一過(guò)程中最為重要的誘導(dǎo)因子，是具有相似作用的一類因子中作用最強(qiáng)的〔20～22〕。

干細(xì)胞可以在特定條件下分化成為多種不同的組織器官而被廣泛應(yīng)用于各種疾病的治療中〔23，24〕。與骨髓干細(xì)胞類似，ADSCs由脂肪組織提取而來(lái)，因此來(lái)源較其他干細(xì)胞更廣泛。以往人們認(rèn)為脂肪是人體肥胖之源，瘦身后抽出的脂肪組織都當(dāng)成廢棄物丟棄，現(xiàn)經(jīng)由醫(yī)學(xué)專家研究證實(shí)，同骨髓中存在造血干細(xì)胞一樣，脂肪組織中同樣含有大量的間質(zhì)干細(xì)胞，這種間質(zhì)干細(xì)胞也具有體外增生及多重分化的潛力。

VEGF是一種二聚體蛋白，其分子量為34～ 50 kD，其主要作用機(jī)制有①通過(guò)增加微血管的通透性，使得血管中的分子透過(guò)血管壁到達(dá)血管外，也是腫瘤細(xì)胞可以透過(guò)血管壁進(jìn)入血液，即造成腫瘤的血液轉(zhuǎn)移；②通過(guò)作用于EC上相應(yīng)受體而促進(jìn)EC的增殖。通過(guò)以上作用機(jī)制為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移提供了有利的條件〔25～28〕。大量研究證實(shí)在各種腫瘤患者血液中VEGF含量均明顯升高〔29～33〕。腫瘤的轉(zhuǎn)移需要經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的過(guò)程，在其中生長(zhǎng)出血管是其轉(zhuǎn)移過(guò)程必須包括的一步。相關(guān)研究表明MVD與腫瘤生物學(xué)特性有密切的關(guān)系〔34～37〕，因腫瘤血管可以為腫瘤提供重要的營(yíng)養(yǎng)支持，在尚未形成血管的時(shí)候，腫瘤是很少甚至不發(fā)生轉(zhuǎn)移的，隨著發(fā)病時(shí)間的延長(zhǎng)，慢慢地在其中生成血管且數(shù)量逐漸增多，這使得腫瘤細(xì)胞獲得充足營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行增殖，并且進(jìn)入血管的機(jī)會(huì)也大為增加，這與其周圍環(huán)境有利于其進(jìn)入血管有關(guān)。眾多研究發(fā)現(xiàn)，隨著MVD的增加腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等惡性潛能也明顯增加〔38～40〕。

本研究結(jié)果顯示ADSCs 內(nèi)VEGF基因沉默后VEGF明顯降低，與MKN45胃癌細(xì)胞混合后接種對(duì)胃癌組織血管形成和胃癌生長(zhǎng)無(wú)影響。