海藻酸鈣/聚乙烯醇水凝膠的制備及其性能

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(1.東華大學化學化工與生物工程學院，上海 201620； 2.紡織面料技術教育部重點實驗室，上海 201620)

1 引 言

水凝膠是一種通過共價鍵、氫鍵或范德華力等作用相互交聯而構成的具有三維網狀結構、能在水中溶脹并保持大量水分而又不溶解的聚合物[1-3]。因其具有高含水量、柔軟靈活、優異的生物相容性等性質而被廣泛應用于生物醫學領域，如藥物控釋、隱形眼鏡、創傷敷料和組織工程支架等[4-6]。海藻酸鈉是一種提取自海藻的天然多糖，是由β-D-甘露糖醛酸(M單元)與α-L-古羅糖醛酸(G單元)依靠β-1,4-糖苷鍵連接形成的線性共聚物。海藻酸鈉具有良好的生物相容性、可降解性，且經濟環保，已經在食品工業和醫藥領域得到了廣泛應用[7]。海藻酸鈉溶液可以通過添加二價陽離子(如Ca2+、Ba2+等)形成水凝膠，而且凝膠轉變條件溫和[8]。

聚乙烯醇是聚醋酸乙烯酯水解得到的水溶性聚合物，安全無毒。在形成凝膠過程中，聚乙烯醇分子鏈間羥基的氫鍵作用可形成纏繞結構，使凝膠具有優異的力學性能[9]。將聚乙烯醇引入海藻酸鹽水凝膠可以提高海藻酸鹽水凝膠的力學性能，從而實現海藻酸鈉和聚乙烯醇的性能互補。海藻酸鹽/聚乙烯醇水凝膠兼具海藻酸鈉良好的生物相容性、親水性和PVA優異的機械性能，具有較廣泛的應用前景[10-11]。通常，海藻酸鈣/聚乙烯醇水凝膠的制備方法是先將聚乙烯醇和海藻酸鈉溶液經過冷凍-解凍操作形成半互穿網絡結構，然后再通過浸泡CaCl2的方式進行離子交聯形成海藻酸鈣/聚乙烯醇互穿網絡水凝膠[12]。這種方法在實際操作中，由于Ca2+與海藻酸的結合速度非常快，容易形成局部凝膠，而且凝膠表面的致密層限制了Ca2+的滲透，導致凝膠內部交聯程度的差別，最終難以得到均勻規整的水凝膠。

本文通過鈣離子原位釋放交聯的海藻酸鈉與凍融循環交聯的聚乙烯醇形成互穿網絡結構來制備海藻酸鈣/聚乙烯醇水凝膠。首先將Ca2+與乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na·2H2O)螯合，并均勻分布于海藻酸鈉和聚乙烯醇的混合溶液中，然后通過D-葡萄糖酸內酯(GDL)的水解，從螯合體系中釋放出來的Ca2+與海藻酸鈉形成離子交聯。海藻酸鈉離子交聯的同時，對混合溶液進行凍融循環操作從而得到海藻酸鈣/聚乙烯醇水凝膠。該制備方法克服了浸泡CaCl2法交聯不均勻的缺點，得到的水凝膠交聯更加均勻，具有均一規整且孔隙率較高的多孔結構，為水凝膠優異的吸水保濕性提供了結構基礎，也能夠保持水凝膠良好的力學彈性。

2 實驗部分

2.1 實驗試劑

聚乙烯醇(含量≥99%)、海藻酸鈉(CP)、乙二胺四乙酸二鈉(AR)；D-葡萄糖酸內酯(AR)；氯化鈣(AR)；氫氧化鈉(AR)。

2.2 水凝膠的制備

2.2.1Ca-EDTA緩沖溶液的配制 將3.73g EDTA-2Na·2H2O分散于一定體積的蒸餾水中，攪拌使其充分溶解后再緩慢加入1.11g CaCl2固體，超聲使其完全溶解，Ca2+與EDTA摩爾比為1∶1。最后采用1M NaOH將混合溶液的pH調至7.0，制成100mL 0.1 M的Ca-EDTA溶液備用[3]。

2.2.2CA/PVA水凝膠的制備 準確稱取海藻酸鈉粉末溶于蒸餾水中，配制一定濃度的海藻酸鈉溶液，放置過夜使其完全溶解后備用。準確稱取聚乙烯醇，并加入蒸餾水，95℃以上水浴加熱溶解均勻后備用。室溫下，將上述海藻酸鈉溶液和聚乙烯醇溶液混合均勻后，加入一定體積的Ca-EDTA溶液和現配的GDL溶液，Ca-EDTA和GDL的摩爾比為1∶2，攪拌均勻后將混合溶液倒入模具內。然后將模具放入冰箱冷凍12h，室溫下解凍。重復凍融過程，使得PVA 能夠充分交聯得到CA/PVA水凝膠。CA水凝膠為海藻酸鈉含量為2wt%的純海藻酸鈉水凝膠，不經過凍融循環操作；PVA水凝膠含有7wt%的PVA，只進行凍融循環操作。

2.3 凝膠分數的測定

取定量的水凝膠樣品干燥至恒重，稱取其質量(W0)，將其放入去離子水中，室溫下浸泡3天以除去未反應的單體。然后再將其干燥至恒重，稱取質量(W1)，計算凝膠分數。每個系列樣品至少測試3次，結果取平均值。凝膠分數(GF)按式(1)計算[13]：

(1)

2.4 形貌觀察

將冷凍干燥后的水凝膠樣品，在液氮中淬斷，對其橫斷面進行噴金處理，采用TM-1000型掃描電子顯微鏡(SEM)觀察水凝膠的微觀形貌。

2.5 性能測試

2.5.1熱穩定性測試 采用TG209 F1型熱重分析儀對冷凍干燥后的水凝膠樣品進行熱穩定性分析。將3.0mg左右待測樣品放置于開放的鋁盤里，在氮氣氛圍中，氣體流速設定為20mL/min，將樣品在50～700℃范圍內勻速升溫，升溫速度為10℃/min，記錄熱失重變化曲線。

2.5.2吸水保濕性測試 將制備的水凝膠樣品干燥至恒重(Wd)放入去離子水中，室溫下保持一定時間后取出，用濾紙擦干表面的水分，記錄下此時水凝膠的質量(Wt)，水凝膠的吸水溶脹比(SR)按式(2)計算[13]：

(2)

將溶脹平衡的水凝膠樣品放在25℃，濕度為60%的恒溫恒濕箱中，每隔一段時間取出稱重，記為Wt，通過含水量的動態變化來表征水凝膠的保水性能。含水量(WC)按式(3)計算[14]：

(3)

2.5.3動態流變性測試 將制備的水凝膠使用裁刀切割成直徑25mm，厚度2mm的圓片，于ARES-RFS型旋轉流變儀上測定其流變性能。選用直徑為25mm的平行板測量系統在25℃下進行測試。首先測試水凝膠在6.28Hz時的應變掃描曲線，然后在應變線性區內對凝膠進行動態頻率(0.1～100Hz)掃描。

2.5.4拉伸性能測試 將水凝膠切成長條狀(40×10mm)在H5K-S型萬能材料試驗機上進行拉伸測試，拉伸速率為50mm/min，至樣品斷裂時停止。每個系列樣品至少測試3次，結果取平均值。水凝膠的拉伸強度為凝膠最大拉伸應力與樣品截面面積的比值；斷裂伸長率為拉伸斷裂時樣品形變長度與初始長度的比值。

2.5.5CKK-8細胞毒性測試 采用豬髖內皮細胞(PIEC)測試水凝膠浸提液的細胞毒性，測試時長24 h。將冷凍干燥后的水凝膠樣品，切成10×10mm大小，放入含有10%胎牛血清、青霉素100U/mL及鏈霉素100U/mL的DMEM培養基中，37℃下浸提24h。同時，在96孔板中接種100μL細胞密度為5×103/mL的細胞懸液，將培養板放于37℃，5% CO2培養箱中預培養24h。然后更換新的培養基，并向實驗組中加入30μL浸提液，將培養板放在培養箱中孵育1天。最后，向每孔加入含10% CKK-8的無血清DMEM培養基，放于培養箱中孵育1小時后，用酶標儀測定在450nm處的吸光度。以DMEM培養基作為對照組(Control)。

3 結果與討論

3.1 水凝膠的制備條件對凝膠分數的影響

水凝膠的結構與性能一方面取決于高分子材料的種類及性質，另一方面取決于水凝膠的制備條件。本研究采用鈣離子原位釋放法和凍融循環法相結合制備海藻酸鈣/聚乙烯醇(CA/PVA)互穿網絡水凝膠，機理如圖1所示。首先將Ca2+與EDTA-2Na螯合，并均勻分布于海藻酸鈉與聚乙烯醇的混合溶液中，然后通過GDL的水解，Ca2+逐漸從螯合體系中釋放出來并與海藻酸鈉形成離子交聯。同時，對混合溶液進行凍融循環操作從而得到海藻酸鈣/聚乙烯醇水凝膠。Ca2+含量和凍融循環次數等都會影響水凝膠網絡結構的形成，最終影響水凝膠的各項性能。水凝膠制備條件對其結構的影響反映在網絡交聯程度及均勻性上，本文采用凝膠分數(Gel fraction)來表征制備條件對水凝膠交聯程度的影響。

圖1 CA/PVA水凝膠制備機理Fig.1 Schematic illustration of CA/PVA hydrogels

固定海藻酸鈉用量為2wt%，PVA為7wt%，Ca-EDTA與GDL摩爾比為1∶2，凍融循環3次，通過改變Ca2+的用量(5、10、15、20 mM)，來探究Ca2+用量對凝膠分數的影響。圖2為不同Ca2+制備水凝膠的凝膠分數變化曲線，可以看出水凝膠的凝膠分數隨著Ca2+用量的增加呈現先增加后減少的趨勢。Ca2+可對海藻酸鈉進行離子交聯，使得海藻酸鈉在水凝膠中起到很好的支架作用，與PVA形成完善的三維網絡結構。采用Ca2+原位釋放法可以保證Ca2+在凝膠混合溶液中均勻分布，從而使得所制備的水凝膠具有均勻分散的交聯點，網絡結構規整一致。隨著Ca2+用量的增加，海藻酸鏈的有效交聯越多，形成的網絡結構越完善規整，所以凝膠分數增加。但是在海藻酸鈉含量一定的情況下，繼續增加Ca2+用量，離子交聯迅速增加，交聯點增多，一定程度上限制PVA分子鏈的移動，從而阻礙PVA分子鏈間氫鍵的形成，所以凝膠分數減小。

圖2 Ca2+含量對CA/PVA水凝膠凝膠分數的影響Fig.2 Effect of Ca2+concentration on the gel fraction of CA/PVA hydrogels

圖3 凍融循環次數對CA/PVA水凝膠凝膠分數的影響Fig.3 Effect of freeze-thawing times on the gel fraction of CA/PVA hydrogels

固定海藻酸鈉用量為2wt%，PVA為7wt%，Ca-EDTA與GDL摩爾比為1∶2，Ca2+的用量為10mM，通過改變凍融循環次數(2、3、4、5)，來探究凍融循環次數對凝膠分數的影響。圖3為不同凍融循環次數下水凝膠的凝膠分數變化曲線。可以看出，隨著凍融循環次數的增加，水凝膠的凝膠分數逐漸增大，凍融4次后凝膠分數增勢趨緩，說明水凝膠已形成完善的網絡結構。PVA分子鏈經冷凍后，分子鏈內和分子鏈間的羥基接觸，形成交聯節點。而未發生交聯的PVA分子鏈在解凍后仍具有一定的運動能力，這使得相互接觸的羥基經再次冷凍后形成新的交聯節點[15]。因此，隨著凍融循環次數的增加，PVA的交聯密度增大，PVA分子鏈和海藻酸鈉分子鏈共同形成致密的三維網格，水凝膠的凝膠分數增加。多次凍融循環后，PVA分子鏈交聯點基本固定，活動性減弱，所以繼續增加凍融循環，凝膠分數增大趨勢不明顯。

3.2 形貌分析

圖4是CA水凝膠，PVA水凝膠和CA/PVA水凝膠的SEM圖。由圖4a可見，CA水凝膠具有疏松均勻的開孔結構，孔隙相互貫通，孔徑分布范圍為100～200μm，孔壁規整。PVA水凝膠(圖4b)也具有多孔結構，但多孔結構更加緊湊，孔徑尺寸明顯減小，孔密度較高。CA/PVA水凝膠(圖4c)的多孔結構兼具前兩者的優勢，具有規則均勻的多孔結構，孔洞相互貫通，孔隙率較高，孔徑尺寸居中，沒有明顯的微相分離，這表明海藻酸鈉和PVA大分子鏈具有很好的相容性。Ca2+原位釋放和多次凍融循環的結合使得水凝膠具有均一的網絡結構，從而使得多孔結構均勻規整。海藻酸鈉分子鏈通過Ca2+離子交聯作用后，在水凝膠中起到很好的支架作用，使得水凝膠的孔洞變大，同時又兼具PVA緊密纏繞的網絡結構。CA/PVA水凝膠均勻多孔的骨架結構不僅提供了水分子進出水凝膠的通道，為水凝膠優異的吸水保濕性能提供了一定的結構基礎，也使得水凝膠保持良好的力學彈性。

圖4 水凝膠的掃描電鏡照片 (a) CA水凝膠； (b) PVA水凝膠； (c) CA/PVA水凝膠Fig.4 SEM images of hydrogels: (a) CA; (b) PVA; (c) CA/PVA

3.3 水凝膠性能研究

3.3.1熱穩定性 圖5為三種水凝膠的熱失重曲線，三種水凝膠具有不同的熱分解曲線，其熱穩定性各不相同。熱分解第一階段發生在30～100℃之間，CA水凝膠對應于熱重曲線上有10%的失重，即為分子內結合水的丟失，而CA/PVA水凝膠，PVA水凝膠在這一階段的失重依次減少，這說明水凝膠內部所含結合水依次減少。在快速分解階段，CA/PVA水凝膠的起始分解溫度居中，PVA水凝膠結晶結構最多，熱穩定性最好，這說明PVA的加入能有效提高海藻酸鈉水凝膠的熱穩定性。

圖5 水凝膠的熱失重分析 (a) CA水凝膠； (b) CA/PVA水凝膠； (c) PVA水凝膠Fig.5 TGA curves of hydrogels (a) CA; (b) CA/PVA; (c) PVA

3.3.2吸水保濕性 圖6為不同PVA含量的CA/PVA水凝膠的動態吸水與保濕性能。由圖6(a)可看出，在吸水溶脹開始的前3h內，凝膠快速吸水，吸水溶脹率增加較快，隨著溶脹時間的延長，溶脹率增加緩慢，最終趨于平衡。同時可得出結論，隨著PVA含量的增加，水凝膠的溶脹性逐漸減弱，所以可以通過控制水凝膠中PVA的含量來控制水凝膠的溶脹性。由圖6(b)可看出，在保水性測試開始后的前3h內，水凝膠保水性較好，含水量減小較少，隨著時間的延長，水凝膠的吸水保濕性變差，含水量迅速減少，但在PVA含量低于9wt%時，水凝膠的8h時含水量仍保持在50%以上，這說明CA/PVA水凝膠具有較好的保濕性。

3.3.3動態流變性 圖7為CA/PVA水凝膠在0.1%應變下儲能模量G′隨頻率變化的曲線。可以看出在整個頻率范圍內，不同CA/PVA水凝膠的G′各不相同，并且G′不依賴于頻率變化。儲能模量G′是衡量材料剛度的一個重要參數，水凝膠的G′越大，其強度越高[16]。由圖7a可看出，CA水凝膠儲能模量較低，添加2wt%的PVA后，水凝膠的強度顯著增加。而且隨著水凝膠中PVA含量的增加，水凝膠的G′呈現增加趨勢，即水凝膠的強度增大。由圖7b可看出，隨著水凝膠凍融循環次數的增加，水凝膠的強度逐漸增大。這與凝膠分數測試的結果一致，隨著凍融循環次數的增加，水凝膠的網絡結構更加完善，從而強度增大。

圖7 CA/PVA水凝膠儲能模量G′隨頻率變化曲線 (a) 不同PVA含量的CA/PVA水凝膠； (b) 不同凍融循環次數下CA/PVA水凝膠Fig.7 Storage modulus of hydrogels as functions of frequencys (a) CA/PVA hydrogels with different PVA content; (b) CA/PVA hydrogels with different freeze-thawing times

3.3.4拉伸性能 對所制備CA/PVA水凝膠進行拉伸性能測試，結果如圖8所示。圖8a為不同PVA含量的CA/PVA水凝膠的拉伸強度和斷裂伸長率。當PVA含量為0時，水凝膠的強度較低，無法進行拉伸性能測試。隨著PVA含量的增加，水凝膠的拉伸強度不斷增強。這是由于PVA分子鏈經過凍融循環操作后，發生大量分子內、分子間氫鍵作用，從而與海藻酸鈉分子鏈形成互穿網絡結構，起到機械增強作用。隨著PVA含量的增加，水凝膠的交聯密度增加使得水凝膠的網絡結構更加緊密，從而受到外力作用時，應力可以被均勻分散，拉伸強度和斷裂伸長率均有所增加。圖8b為不同凍融循環次數后的CA/PVA水凝膠的拉伸強度和斷裂伸長率。可看出，隨著凍融循環次數的增加，水凝膠的拉伸強度和斷裂伸長率顯著增大。這是由于PVA分子鏈間、分子內氫鍵作用力隨著凍融循環次數的增加而增大，PVA的交聯密度增大，分子鏈的規整性較好，水凝膠形成致密的網絡結構。規整的交聯結構使得水凝膠抵御外力作用的能力加強，從而拉伸強度和斷裂伸長率均有所增加，這一結果與凝膠分數、流變測試結果一致。

3.3.5細胞毒性 圖9為豬髖內皮細胞的細胞毒性實驗結果。采用OD值的大小來表征細胞存活率的大小，OD值越高，細胞存活率越高。由圖9可看出，三種水凝膠樣品的浸提液均對豬髖內皮細胞的存活率沒有消極影響。和對照組相比，三種水凝膠的浸提液所測得的OD值并未減少，這說明三種水凝膠均無細胞毒性，具有很好的細胞相容性。海藻酸鈉是生物相容性較好的天然多糖，聚乙烯醇是安全無毒的水溶性聚合物，并且制備過程中并無使用有毒物質，所以所制備的水凝膠不僅安全無毒，而且細胞相容性較好，有利于細胞增殖。

圖8 CA/PVA水凝膠拉伸性能 (a) 不同PVA含量下CA/PVA水凝膠； (b) 不同凍融循環次數下CA/PVA水凝膠Fig.8 Tensile properties of CA/PVA hydrogels (a) CA/PVA hydrogels with different PVA content; (b) CA/PVA hydrogels with different freeze-thawing times

圖9 水凝膠的細胞存活率Fig.9 Cell viabilities of hydrogels

4 結 論

通過在海藻酸鈉水凝膠中引入聚乙烯醇組分來構建互穿網絡結構，可以制備得到具有優異生物相容性、吸水保濕性和拉伸性能的海藻酸鈣/聚乙烯醇水凝膠。采用Ca2+從螯合體系中緩慢釋放的方法使海藻酸鈉的交聯更加均勻，所形成水凝膠的微孔分布更加均一，為水凝膠優異的吸水保濕性提供了結構基礎，也使得水凝膠能夠保持良好的力學彈性。鈣離子原位釋放法和凍融循環法的有效結合使得所制備水凝膠的網絡結構更加均勻規整，能進一步拓寬海藻酸鈣/聚乙烯醇水凝膠的應用領域。