大湘西野生獼猴桃果肉中酵母菌的分離鑒定及其耐受性研究

伍 強,彭娟娟,余有貴,萬 常,肖長元,王美麗

(1.邵陽學院 食品與化學工程學院,湖南 邵陽 422000;2.邵陽市釀酒工程技術研究中心,湖南 邵陽 422000)

大湘西涵蓋湘西土家族苗族自治州、懷化市及邵陽、永州的部分縣市等湖南西部地區,氣候溫和,雨量充沛,適宜野生獼猴桃(Actinidia chinensis)生長[1]。野生獼猴桃具有較高的營養價值,適合老人、兒童及孕婦食用[2]。目前,獼猴桃果酒通常采用安琪酵母、葡萄酒酵母等商業酵母進行釀造[3-4],由于缺乏更適合獼猴桃發酵的專用菌種和成熟的發酵技術,該果酒在色、香、味等品質上并不理想[5],且不同產地或品種的獼猴桃所釀造的果酒品質差別較大[6]。為提高果酒品質,國內外學者通過形態學觀察、生理生化實驗及分子生物學鑒定等手段已分離篩選出適于果酒發酵的野生酵母菌,但近年來國內對獼猴桃果酒的野生酵母菌研究尤為關注[7-12]。羅安偉等[8]篩選獲得3株酵母菌,菌株YZ1產酒精度為9.4%vol,其發酵最適pH為4.5,但未研究其耐高溫、耐乙醇等性能;郝瑤等[9]通過分離、顯微鏡觀察、WL培養基篩選和鑒定,確定發酵能力較好的菌株Y-41為庫德里阿茲威氏畢赤酵母(Pichia kudriavzevii),該菌株在pH為3.0～4.5范圍內生長代謝良好,當酒精度＞12%vol時受到嚴重抑制;徐清萍等[11]分離篩選獲得1株發酵能力好、耐受性強的酵母菌,耐酒精度為12%vol,耐糖度為150 g/L,在pH 2.0～4.0范圍內能生長,但未進一步鑒定該菌株種屬。大湘西是我國獼猴桃第二大產地,尤其在邵陽地區資源豐富,目前未見大湘西野生獼猴桃酵母菌的相關報道。

因此,本研究以大湘西野生獼猴桃為菌種分離源,通過分離純化、鑒定和耐酒精度、pH、耐高溫、耐糖濃度等發酵性能試驗,篩選耐受性較強并適用于獼猴桃果酒發酵的優勢野生酵母菌,為開發大湘西野生獼猴桃釀酒酵母資源提供前期技術儲備。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

野生獼猴桃:邵陽市綏寧縣金水灣生態現代生態農業不范園。

1.1.2 試劑

安琪果酒酵母:安琪酵母股份有限公司;果膠酶(50000U/g):寧夏和氏璧生物技術有限公司;十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammoniumbromide,CTAB)、蛋白酶K(30 U/g)、聚合酶鏈式反應(polymerasechain reaction,PCR)緩沖液、脫氧核糖核苷酸三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate,dNTP):北京寶杰羅生物科技有限公司。實驗所用試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

分離培養基[13]采用酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptonedextrose,YEPD)培養基,115℃滅菌30 min;WL營養瓊脂培養基[14]:高溫121℃滅菌20 min;獼猴桃培養基:選八成熟、發軟的野生獼猴桃,清洗干凈,去皮打漿,然后加入質量分數為0.1%果膠酶攪拌均勻,35℃酶解3 h。取上清液于三角瓶中,68℃水浴處理(滅菌)20 min。

1.2 儀器與設備

101-2AB型電熱恒溫培養箱:天津市泰斯特儀器有限公司;SW-CJ-1FD型單人單面垂直凈化工作臺:蘇州博萊爾凈化設備有限公司;BA310型數碼顯微鏡:麥克奧迪(廈門)實業集團有限公司;JYL-C012型打漿機:九陽股份有限公司;EL20型pH計:梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-1780型紫外可見分光光度計:日本島津儀器有限公司;JI54DWS型高壓滅菌鍋:致微(廈門)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 野生獼猴桃果肉中酵母菌的初步分類

無菌條件下稱取10 g新鮮的野生獼猴桃果肉于無菌研缽中研成果漿,轉移至裝有90 mL無菌水的三角瓶,混合均勻后靜置15 min。以無菌水對漿液進行梯度稀釋,吸取10-1稀釋液2μL涂布于WL營養瓊脂培養基,28℃培養5 d后,根據菌落形態及顏色進行初步分類[14]。

1.3.2 野生獼猴桃果肉中酵母菌的分離篩選及純化

吸取野生獼猴桃10-1稀釋液2μL涂布于YEPD平板培養基上,于28℃培養3 d。挑選典型的酵母單菌落平板劃線繼代2次獲得純化菌種。將純化菌種劃線接種于YEPD斜面培養基上,28℃培養2 d,待菌落生成后,直立放置于4℃保存。

將上述純化菌株接種于YEPD液體培養基,28℃恒溫培養箱中靜置24h進行活化,調整種子液濃度為1.0×108CFU/mL,以3%接種量(V/V)接種于裝液量為200 mL/500 mL獼猴桃培養基中,在無菌條件下用檸檬酸鈉將pH調整為3.8,并用棉塞和保鮮膜對三角瓶進行密封,于28℃靜置發酵48 h,觀察其發酵現象,并記錄起酵時間,選取氣泡生成較多、具有典型酒香生成的菌株做進一步研究[15]。

1.3.3 野生獼猴桃果肉中酵母菌的鑒定

形態學鑒定[14,16]:將上述篩選獲得的酵母菌株分別劃線接種于WL營養瓊脂培養基,28℃培養5d后,觀察菌落形態及顏色。結合WL營養瓊脂培養基分類結果,對該酵母菌進行鏡檢,于油鏡下觀察每株酵母菌的細胞形態。

分子生物學鑒定[17]:提取分離篩選獲得的酵母菌的脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA),以其為模板進行PCR擴增,釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)采用引物NL-1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL-4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)進行PCR擴增,其它酵母則采用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行PCR擴增。PCR擴增條件為:95℃、10 min;95℃、30 s,55℃、30s,70℃、1min,35個循環;72℃、10min。PCR擴增體系:雙蒸水(ddH2O)17.8μL,Buffer(Mg2+Plus)3μL,dNTP(25 mmol/L)2μL,NL1/ITS1(10 mmol/L)3μL;NL4/ITS4(10 mmol/L)3μL;DNA模板1μL,Taq酶(5 U/L)0.2μL。將PCR產物送至北京六合華大基因有限公司進行測序,并在GenBank核酸序列數據庫中進行同源序列比對,采用MEGA.6.0軟件的鄰近法(neighbor joining,NJ)構建系統發育樹。

1.3.4 野生獼猴桃果肉中酵母菌的耐受性研究

以安琪果酒專用酵母為對照,采用杜氏管發酵法[15]對酵母菌進行發酵,酵母菌種子液濃度為1.0×108CFU/mL,以3%接種量(V/V)將酵母菌種子液接種于乙醇、pH、糖及溫度等各脅迫條件下的獼猴桃培養基,于28℃靜置發酵3 d,分別觀察并記錄酵母細胞在不同乙醇濃度(4%vol、6%vol、8%vol、10%vol、12%vol)、pH(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0)、糖質量濃度(150 g/L、200 g/L、250 g/L、300 g/L、350 g/L)、發酵溫度(26℃、28℃、30℃、33℃、37℃)條件下的產氣情況。根據產氣充滿杜氏管時間分為0～5級,0級:不產氣;1級:72 h時產氣充滿杜氏管;2級:60 h時產氣充滿杜氏管;3級:48 h時產氣充滿杜氏管;4級:36 h時產氣充滿杜氏管;5級:24 h時產氣充滿杜氏管。

2 結果與分析

2.1 野生獼猴桃果肉中酵母菌的初步分類

野生獼猴桃中酵母菌較為豐富,徐清萍等[11]利用WL培養基顏色變化和顯微鏡觀察,從河南平頂山野生獼猴桃鮮果中共初篩出136株酵母菌。王榮榮等[18]以獼猴桃果肉為原料,利用WL培養基觀測形態、杜氏管發酵,篩選獲得釀造獼猴桃酒的優良酵母。為探究大湘西野生獼猴桃果肉中酵母菌的種類,并篩選鑒定出發酵性能優良的獼猴桃果酒酵母,將野生獼猴桃果漿涂布于YEPD培養基和WL營養瓊脂培養基上恒溫培養,觀察酵母形態特征。酵母菌菌群在YEPD培養基和WL營養瓊脂培養基的菌落生長情況見圖1。

圖1 野生獼猴桃果肉中酵母菌群在YEPD培養基(A)和WL營養瓊脂培養基(B)上的生長情況Fig.1 Growth situation of yeasts from wild kiwifruit pulpa on YEPD medium(A)and WL nutrient agar medium(B)

由圖1A可知,參照楊瑩等[19]的分類方法,野生獼猴桃果肉中酵母菌群至少可分成6類,分別為克魯維畢赤酵母(Pichia kluyveri):白色,邊緣有不規則小突起;釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae):乳白色,表面光滑不透明、平板上有酒香;紅酵母(Rhodotorula sp.):紅色,球形突起、表面光滑黏稠、呈黃油狀;葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum):中央深綠色、邊緣淡綠色,扁平、表面光滑不透明、呈黃油狀;粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyccspombe):深綠色,菌落很小、表面光滑不透明、呈黃油狀;全美梅氏酵母(Metschnikowia pulcherrima):紅棕色,菌落小、表面突起不透明等。因此,大湘西野生獼猴桃果肉中酵母菌的種類可能包含畢赤酵母、釀酒酵母、紅酵母、葡萄汁有孢漢遜酵母、粟酒裂殖酵母和全美梅氏酵母6類酵母。

2.2 野生獼猴桃果肉中酵母菌的分離篩選

從YEPD培養基上隨機挑取30株菌種作進一步分離純化,分別編號為JM1～JM30,并利用獼猴桃培養基發酵性能試驗對30株酵母菌進行篩選。在釀酒過程中若釀酒酵母起酵太慢,野生酵母菌、霉菌和細菌等將會迅速生長代謝,進而可能抑制釀酒酵母的生長代謝,造成獼猴桃果酒風味缺陷甚至使發酵液發酵滯緩。為縮短獼猴桃果酒的發酵周期,選擇能在48 h之內快速啟動發酵的酵母菌株。研究發現,分離純化獲得的30株野生獼猴桃酵母菌中JM1、JM11、JM12菌株的起酵時間均能在48 h之內快速啟動發酵。因此,初步確定JM1、JM11、JM12為發酵性能優良的酵母菌。

2.3 野生獼猴桃果肉中酵母菌的鑒定

形態學鑒定:酵母菌JM1、JM11、JM12的細胞形態及在YEPD和WL培養基上的菌落形態結果見圖2。

由圖2可知,菌株JM1、JM11、JM12在YEPD培養基上具有不同的菌落形態特征,其中菌株JM11、JM12菌落為白色,菌株JM1菌落為乳白色,但菌落較小。菌株JM1與JM11、JM12在WL營養瓊脂培養基上菌落形態及顏色差異并不明顯,三者均呈白色。其中,菌株JM11與JM12菌落表面光滑不透明,且平板上有酒香。鏡檢結果顯不菌株JM1、JM11、JM12均與酵母細胞形態相似,呈圓形或橢圓形。

圖2 野生獼猴桃果肉中酵母菌的菌落形態及細胞形態Fig.2 Colony and cell morphology of yeasts from wild kiwifruit pulpa

分子生物學鑒定:為進一步鑒定分離篩選獲得的野生酵母菌JM1、JM11、JM12的種屬,利用引物對NL1/NL4對菌株JM11和JM12的基因序列進行PCR擴增,采用引物對ITS1/ITS4對菌株JM1的基因序列進行PCR擴增,采用瓊脂糖凝膠電泳進行驗證,結果如圖3所不。

圖3 野生獼猴桃果肉中酵母菌JM1、JM11和JM12的PCR擴增產物Fig.3 PCR amplification products of yeasts JM1,JM11 and JM12 from wild kiwifruit pulpa

由圖3可知,菌株JM1擴增產物的堿基長度約為580bp,菌株JM11和JM12擴增產物的堿基長度均約為550 bp。將所得序列提交至GenBank核酸序列數據庫進行同源性比對,選取同源性較高的菌株構建系統發育樹,結果見圖4。

圖4 菌株JM1、JM11和JM12的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strains JM1,JM11 and JM12

由圖4可知,菌株JM1與克魯維畢赤酵母(Pichiakluyveri)和庫德畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)聚于一支,序列的相似性為99%,而菌株JM11和JM12與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)聚于一支,親緣關系較近。結合菌株的菌落特征和細胞形態觀察,鑒定所篩選的野生獼猴桃酵母菌JM1可能為克魯維畢赤酵母(Pichia kluyveri)或庫德畢赤酵母(Pichia kudriavzevii),菌株JM11和JM12為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。克魯維畢赤酵母常用于生產乙酸戊二酯等香味物質[20],釀酒酵母是果酒發酵最重要的微生物[21],在調味劑、發酵食品等行業具有廣闊的應用前景。

2.4 野生獼猴桃果肉中酵母菌的耐受性研究

采用杜氏管發酵法研究酵母菌JM1、JM11和JM12在不同乙醇濃度、pH、糖濃度和溫度下的產氣情況,根據各菌株發酵使杜氏管充滿CO2的時間判斷其在各脅迫環境下的發酵能力,以安琪果酒專用酵母為對照(Control),耐受性試驗結果如圖5所不。

釀酒酵母對高酒精含量的耐受性是釀酒酵母的重要特征,酒精耐受性強能使其發酵徹底,大大提高獼猴桃酒的酒精度[22]。由圖5(A)可知,相較于安琪果酒專用酵母,野生酵母JM1、JM11和JM12都能耐受高濃度乙醇。其中,菌株JM12對乙醇的耐受性最高,在乙醇含量為12%vol時,產氣48 h充滿杜氏管,而菌株JM11次之(產氣60 h充滿杜氏管),菌株JM1的乙醇耐受性最差,但仍能在含12%vol乙醇濃度的發酵基質中發酵產氣。

野生獼猴桃富含有機酸、維生素C(vitamin C,VC)等營養成分,口味偏酸,應篩選出耐酸的釀酒酵母菌用于野生獼猴桃果酒釀造[23]。由圖5(B)可知,3株野生獼猴桃酵母均能耐受pH＜3.5的發酵基質。其中,菌株JM1的耐pH最好,當pH＞3.0時,均在24 h內快速產氣充滿杜氏管,甚至優于安琪果酒專用酵母。菌株JM11次之(產氣60h充滿杜氏管),但仍可在pH 2.5條件下發酵產氣。菌株JM12耐pH最差,在pH 3.0左右不能發酵產氣。

在葡萄酒工業中,糖是果酒發酵的基礎,也是酵母的能量來源[24]。由圖5(C)可知,耐糖性能強弱排序為菌株JM11＞JM12＞JM1,當糖含量為300 g/L時,分別在產氣48 h、60 h和72h時充滿杜氏管,菌株JM11和JM12均能耐受350 g/L的糖含量;在糖含量為250 g/L時,菌株JM1和JM12的產氣量最多,說明這2株野生酵母菌在糖含量為250 g/L時生長狀況最好,但在糖含量為300 g/L時,菌株JM11產氣情況優于菌株JM12。

圖5 野生獼猴桃果肉中優良酵母菌的乙醇(A)、pH(B)、糖(C)和溫度(D)耐受性試驗Fig.5 Tolerance tests of dominant yeasts from wild kiwifruit pulp on alcohol(A),p H(B),sugar(C)and temperature(D)

南方偏高溫天氣居多,發酵設備安裝保溫系統成本較高,篩選出適于果酒釀制的耐高溫酵母菌株能避免發酵中止等問題[25]。由圖5(D)可知,菌株JM1、JM11和JM12的最適發酵溫度均為28℃,菌株JM1和JM12在33℃時仍可產氣;菌株JM11耐高溫特性則更強,高達37℃。

菌株JM11的乙醇、糖、低pH和高溫耐受性具有明顯優勢,尤其在糖含量達350 g/L仍可產氣,耐高溫37℃。菌株JM12耐乙醇特性雖優于菌株JM1和JM11,耐高溫達33℃,但其低pH耐受性最差,pH 3.0左右便停止產氣,而菌株JM1和JM11均能耐受pH＜2.5的發酵基質。菌株JM1雖低pH耐受性強于菌株JM11和JM12,但耐糖和耐乙醇特性均為最差。綜合考慮,菌株JM11為適用于獼猴桃果酒發酵的優勢野生釀酒酵母。

3 結論

通過對野生獼猴桃果肉中優良酵母菌的分離篩選及分子生物學鑒定,獲得3株野生酵母菌,經鑒定JM1可能為克魯維畢赤酵母(Pichia kluyveri)或庫德畢赤酵母(Pichia kudriavzevii),菌株JM11和JM12均為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。耐受性試驗結果表明,菌株JM11的乙醇、糖、pH和高溫耐受性具有明顯優勢,尤其在糖含量高達350 g/L、高溫37℃、pH低至2.5,乙醇含量為12%vol時仍可產氣,可作為獼猴桃果酒發酵的優勢酵母菌。