硫辛酸胺對損傷血管內膜增生的影響及機制

汪 洋，鮑得俊，程傳東，董永飛，魏祥品，牛朝詩，傅先明，汪業漢

介入手術是治療心腦血管疾病重要手段, 但術后引起的血管內膜損傷后再狹窄是困擾介入治療的難題[1], 而內膜增生(intimal hyperplasia，IH)是血管介入術后再狹窄的病理基礎[2]。研究[3]顯示血管內皮細胞(endothelial cells，ECs)凋亡減弱了血管內皮層的屏障作用，加速斑塊的形成。ECs凋亡后，又可以啟動凝血機制在病變局部形成血栓，加重血管腔狹窄[4]。目前，一些相應的抑制ECs凋亡的藥物被應用到臨床。硫辛酸胺 (α-lipoic acid-plus，LAP) 是硫辛酸(α-lipoic acid，LA)的衍生物，可抑制蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)引起的氧化應激，進而抑制神經細胞的凋亡，與最常見的抗氧化劑LA相比，LAP的抗凋亡作用更強[5]。該研究擬通過球囊壓迫法建立頸動脈內膜損傷動物模型，再予以LAP干預，探討LAP對IH的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑活性氧(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；TUNEL試劑盒購自美國Sigma公司；LAP由大連美侖生物科技有限公司合成，純度100%。Western blot和免疫熒光一抗：Cathepsin B/D、Caspase-3購自英國Abcam公司；Western blot二抗：HRP標記的山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗購自美國Santa Cruz公司；免疫熒光二抗：Alexa Fluor-488 donkey anti-rabbit IgG 抗體、Alexa Fluor-488 donkey anti-goat IgG 抗體購自美國Invitrogen公司。

1.2實驗動物成年健康雄性SD大鼠由上海實驗動物研究中心提供，雄性，300～350 g。所有動物實驗遵照國家實驗動物飼養和使用指南，術前單籠飼養，保持室溫18～22 ℃，自由飲食飲水，安靜、避光環境中飼養。

1.3方法

1.3.1動物模型的建立 10%水合氯醛(藥物效量：4 ml/kg)對SD大鼠進行腹腔注射麻醉。麻醉成功后，將大鼠仰臥于操作臺上，頸部去毛備皮，安爾碘常規消毒。正中偏右0.5 cm切開皮膚，切開頸前肌，牽開胸鎖乳突肌，找到頸動脈分叉處，游離頸內、頸外、頸總動脈。顯微鏡下血管夾夾住頸總動脈，在頸外動脈上剪開一個缺口，球囊裝置塞入缺口沿著管腔一直到達頸總，松開血管夾，球囊裝置繼續向前，大約離分叉處2 cm左右，注射器注水使球囊充盈，關閉閥門，然后沿著管腔來回滑動3次，造成頸動脈內膜損傷。抽出球囊中的水，退出導管，顯微鏡下縫合頸外動脈上的缺口[6]。

1.3.2實驗分組和處理 SD大鼠48只，隨機分為4組，假手術組：12只，只分離頸動脈；血管損傷組：12只，顯微鏡下利用球囊壓迫法建立大鼠頸動脈損傷模型；LAP低劑量組：12只，模型建立后6 h，將LAP(100 mg/kg)與2 ml的甲基纖維素(濃度為0.5%)混合，通過胃管給藥，連續3 d，每天給藥一次；LAP高劑量組：12只，模型建立后6 h，將LAP(150 mg/kg)與2 ml的甲基纖維素(濃度為0.5%)混合，通過胃管給藥，連續3 d，每天給藥一次。

1.3.3氧化應激水平的測定 用ROS、MDA、SOD、GSH-Px試劑盒來進行氧化應激水平的測定。顯微鏡下剝除損傷區域血管內皮層，加入適量生理鹽水研磨成勻漿，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液分裝，分別用作ROS、MDA、SOD、GSH-Px的分析，勻漿中的蛋白濃度由考馬斯亮藍法試劑盒測定。ROS含量的測定選用ROS檢測探針DCF-DA，混合液的熒光強度由熒光酶標儀(FilterMax F5, Molecular Devices)來測定，最佳激發波長為485 nm，最終的ROS的測定結果以熒光強度/mg蛋白表示，根據試劑盒中提供的步驟，類似地測定MDA含量、SOD、GSH-Px的活性。

1.3.4Western blot法 顯微鏡下取適當長度的頸動脈內皮研磨，加入裂解液，離心，4 ℃過夜；Bradford比色法測定總蛋白濃度；制膠，15%分離膠，5%濃縮膠；蛋白樣品100 ℃變性5 min，上樣30 μg；恒壓60 V進膠，當溴酚藍前沿剛進入分離膠后，恒壓100 V跑膠；用轉移槽恒流轉膜，2 h；用麗春紅染液將PVDF膜染色，據目標蛋白分子量將膜進行適當剪切；用PBS浸泡使膜上的麗春紅顏色褪去；用含5% BSA的PBST溶液在室溫下封閉1 h；用含3 % BSA的PBST溶液稀釋一抗(1 ∶1 000)，與含目標蛋白的PVDF膜在4 ℃孵育過夜；用PBST浸泡膜1次，10 min；用PBS浸泡膜2次，每次10 min；用PBS稀釋二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育1 h；用PBS浸泡膜3次，每次10 min；ECL 化學發光底物法暗室中顯色；掃描保存實驗結果，用QUANTITY ONE(v4.6.2)凝膠電泳圖象分析軟件，分析結果。

1.3.5免疫熒光共染 取4 μm的血管石蠟切片,70 ℃烘片2 h，經二甲苯、乙醇脫蠟水化；切片置于10 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中行抗原修復，微波爐加熱(95 ℃)，30 min，自然冷卻至室溫；PBS浸泡3次，每次5 min；0.2% TRItion X-100透化2 min；PBS浸泡3次，每次5 min；0.5%天空藍浸泡10 min；PBS浸泡3次，每次5 min ；10%血清封閉液封閉20～30 min；加一抗(1 ∶100)4 ℃過夜；恢復室溫，PBST浸泡3次，每次5 min；加相應二抗(1 ∶200)37 ℃孵育30 min～1 h(避光)，恢復室溫，PBST浸泡3次，每次5 min；防淬滅封片劑封片；共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.6HE染色 取4 μm的血管石蠟切片,70 ℃烘片2 h，經二甲苯、乙醇脫蠟水化；梯度酒精脫脂。將切片依次放入100%、95%、80%乙醇中各3 min，最后放入自來水中2 min；蘇木精染色30 s；蒸餾水洗片2 min；0.5%鹽酸酒精分化3 s；自來水洗片2 min； 80% 乙醇中15 s；伊紅染色1 min(不可超時)；蒸餾水速洗；脫水，將切片依次放入80%、95%、100%乙醇中各15 s，最后放入二甲苯中10 min；將切片放置通風櫥中干燥，滴加中性樹脂封片；顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.7TUNEL染色 根據TUNEL試劑盒實驗步驟進行染色：① 取4 ～ 6 μm的石蠟切片，預熱70 ℃烤片2 h， 在二甲苯及梯度酒精(100%、95%、90%、80%、70%)溶液中脫蠟；② 預處理：在37 ℃避光保溫箱中，切片浸沒孵育在蛋白酶K溶液(10～20 μg/ml in 10 mol/L TRIs/HCl，pH 7.4～8)浸泡30 min；③ PBS溶液沖洗3次，每次5 min；④ 在37 ℃的避光保溫箱中，滴加TUNEL工作溶液，孵育60 min；⑤ PBS溶液沖洗3次，每次5 min；⑥ 暗室中常溫風干，滴加抗淬滅熒光封片劑，加蓋玻片封存。

2 結果

2.1損傷血管氧化應激水平測定假手術組中ROS、MDA水平很低，而損傷組ROS、MDA水平顯著上升，為對照組的(1.370±0.101)、(1.432±0.089)倍(F=12.32、10.14，P<0.05)；干預組中，LAP能顯著抑制ROS、MDA 的上調，為損傷組的(0.784±0.081)、(0.681±0.078)倍(F=7.75、P<0.05，F=14.67、P<0.01)；同時SOD、 GSH-Px在損傷后活性顯著下降，為對照組的(0.509±0.213)、(0.588±0.093)倍(F=22.69、P<0.01，F=24.35、P<0.01)，但LAP能顯著抑制SOD、GSH-Px的下調，為損傷組的(1.364±0.112)、(1.417±0.056)倍(F=7.45、P<0.05，F=16.78、P<0.01)，其變化趨勢與ROS、MDA含量的變化趨勢相反。不同劑量的LAP抗氧化應激的能力無明顯差異，見圖1。

2.2血管內皮組織中的CathepsinB/D、Caspase-3的表達Western blot 結果顯示，與假手術組比較，損傷組內皮組織中CathepsinB/D，Caspase-3的蛋白水平明顯上升(F=19.35、P<0.01，F=23.65、P<0.01，F=7.86、P<0.05)，LAP能夠顯著抑制CathepsinB/D，Caspase-3的水平(F=21.73、P<0.01，F=11.54、P<0.05，F=8.95、P<0.05)；高劑量的LAP較低劑量LAP能發揮更強的效應(F=9.39，P<0.05，F=17.15、P<0.01)，見圖2。利用免疫熒光方法檢測了血管內皮層中CathepsinB/D表達，損傷組中內皮組織中CathepsinB/D的表達較假手術組輕度增多，但應用LAP干預后，內皮組織中的CathepsinB/D顯著下調，見圖3、4。

2.3TUNEL染色結果與假手術組比較，損傷組內皮層中的ECs凋亡率顯著升高(F=14.35，P<0.01)，LAP處理顯著地降低了ECs的凋亡率(F=7.76、P<0.05，F=25.63、P<0.01)。驗證了LAP通過抑制凋亡，保護ECs的作用，見圖5。

2.4HE染色結果血管損傷后3周，損傷節段血管內可見明顯的內膜增厚，有效管腔面積低于假手術組，為假手術組的(0.764±0.201)倍(F=17.84，P<0.01)，LAP可顯著被抑制IH，有效抑制管腔狹窄，為損傷組的(1.231±0.359)倍(F=7.26，P<0.05)。結果表明LAP能夠抑制損傷血管IH及管腔狹窄，見圖6。

3 討論

內皮損傷是介入治療的特異性損傷，也是一種嚴重的并發癥，內皮損傷與血管內血栓和再狹窄形成密切相關，而促進血管內皮再生，短時間內恢復內皮完整性有助于預防血管再狹窄。當血管內皮損傷后，延遲性再內皮化和IH將會變得不可避免，同時對血管的再狹窄率和血栓的形成發揮很大的作用。目前，文獻[7]報道已經有很多有效的干預措施及藥物來預防血管損傷后的IH。例如，血管周圍應用雷帕霉素可對血管IH呈現持續的抑制作用。在損傷血管局部使用胰島素可顯著減少增生內膜的厚度，增加管腔面積而不影響全身的血糖水平，同時平滑肌細胞的增殖和遷移受到了抑制，因此，胰島素涂支架對血管內手術后的再狹窄提供了保護效應[8]。近年來，ECs凋亡引起延遲再內皮化引起了重視，有多種信號通路參與ECs凋亡，如Ox-LDL可通過PERK/eIF2α/CHOP ER-stress信號通路誘導ECs凋亡[9]。有文獻[10]證實內皮抑素特異性抑制ECs生長、遷移，誘導ECs凋亡，抑制損傷血管的再內皮化，參與了再狹窄形成。另外，有文獻[11]證實姜黃素可抑制ECs的凋亡來促進血管損傷區域再內皮化，繼而抑制血管IH。在前期研究中，Svensson et al[12]已經在實驗中論證了miR-125a在ECs中過表達可抑制ECs的增殖和分化，同時下調Bcl-2 和Caspase-3蛋白水平，激活內部凋亡通路，加速ECs的凋亡，因此，應用miR-125a 抑制劑可能是增加ECs增殖及分化，促進血管損傷后再內皮化的一種重要方法。當血管內皮損傷后，部分紅細胞粘滯在受損的內皮層，繼而發生分解產生血紅蛋白，血紅蛋白的分解產物亞鐵血紅素在血紅素加氧酶的作用下生成二氧化碳和膽綠素，隨之生成具有催化作用的活性鐵，此反應中通過Fenton反應也有大量的ROS的產生[13]。Yu et al[14]前期試驗已經證實細胞的溶酶體內存在一個不穩定、氧化活性鐵池，如果細胞遭受到外界氧化應激損傷時，溶酶體內鐵將會增加細胞損傷的危險。同時，筆者在之前的試驗中證實了SAH后早期腦損傷與神經元與小膠質細胞的凋亡密切相關，其具體表現為SAH后神經細胞內溶酶體膜的通透性增加，破裂的溶酶體數目增多，釋放的Cathepsins將進一步級聯放大溶酶體外的凋亡信號。但這一過程可能有自由鐵的參與，溶酶體酸性環境和高水平的自由鐵促進了Fenton反應，產生了氧化能力更強的羥自由基，損傷并破壞溶酶體膜。而一種親溶酶體內鐵的螯合劑LAP，作為LA的衍生物，結構中含有巰基，可靶向與溶酶體內鐵反應，穩定溶酶體膜，抑制Cathepsins介導的凋亡通路，減輕神經細胞的凋亡，起到腦保護的作用[5]。眾所周知，溶酶體和Cathepsins能級聯放大溶酶體外的凋亡信號在多種疾病中已經被證實[15]。

圖1 損傷血管的氧化應激水平

A：ROS；B：MDA；C：SOD；D：GSH-Px; 1:假手術組；2：血管損傷組；3：LAP低劑量組；4：LAP高劑量組；與假手術組比較：*P<0.05，**P<0.01；與血管損傷組比較：#P<0.05,##P<0.01；與低劑量組比較：&P<0.05

圖2 Western blot檢測CathepsinB/D和Caspase-3的表達水平

A：Cathepsin B; B:Cathepsin D; C:Caspase-3; 1:假手術組；2：血管損傷組；3：LAP低劑量組；4：LAP高劑量組；與假手術組比較：*P<0.05，**P<0.01；與血管損傷組比較：#P<0.05,##P<0.01；與低劑量組比較：&P<0.05

圖3 免疫熒光法檢測Cathepsin B的表達水平×400

A：假手術組；B：血管損傷組；C：LAP低劑量組；D：LAP高劑量組

圖4 免疫熒光法檢測Cathepsin D的表達水平 ×100

A：假手術組；B：血管損傷組；C：LAP低劑量組；D：LAP高劑量組

圖5 TUNEL染色標記凋亡的內皮細胞 ×400

A：假手術組；B：血管損傷組；C：LAP低劑量組；D：LAP高劑量組；與假手術組比較：**P<0.01；與血管損傷組比較：##P<0.01，#P<0.05；與LAP低劑量組比較：&P<0.05

圖6 HE染色評估內膜增生及管腔狹窄情況 HE×100

A：假手術組；B：血管損傷組；C：LAP低劑量組；D：LAP高劑量組；與假手術組比較：**P<0.01；與血管損傷組比較：#P<0.05

綜上所述，ECs凋亡在血管內膜損傷后再內皮化及IH過程中受到廣泛重視，一些相應抑制ECs凋亡的藥物被應用到臨床。但在血管內膜損傷中，Cathepsins介導的ECs凋亡通路卻很少被探討，本次實驗結果提示當血管內膜損傷72 h后，損傷血管內皮層的氧化應激水平、CathepsinB/D、Caspase-3的表達水平及ECs凋亡率明顯上調，但LAP能顯著抑制氧化應激水平、ECs凋亡率及上述蛋白的表達；當血管內膜損傷3周后，HE染色結果顯示損傷節段血管可見明顯的內膜增厚，導致管腔狹窄。而LAP可顯著抑制IH，減輕血管腔的狹窄。因此，LAP抑制大鼠頸動脈球囊損傷后IH，其可能機制為LAP不僅因為其抗氧化的特性，還特異性抑制溶酶體內Cathepsins介導的凋亡通路，減少ECs的凋亡，加速損傷區域內皮修復，從而抑制IH。因此，像此類能抑制溶酶體內Cathepsins的藥物，將會成為治療血管內膜損傷中延遲再內皮化及內膜過度增生的一種新的策略。