一株產抗菌脂肽芽孢桿菌篩選鑒定、產酶特性及其脂肽初步鑒定

胡美忠， 鄔小蘭， 郁建生

（銅仁職業技術學院，貴州銅仁 554300）

畜牧業中抗生素的濫用嚴重威脅到食品安全和人類健康，帶來了藥物殘留、耐藥致病菌、環境污染等弊端。鑒于抗生素濫用的危害，已有多個國家在養殖業中限制甚至禁止使用抗生素，如1992年瑞士立法禁止使用飼用抗生素，歐盟于1999年立法禁止使用抗生素作為促生長劑，我國近幾年針對抗生素在畜牧業中濫用問題，提出禁止或者逐步禁止飼用抗生素的使用，并提出鼓勵和支持抗菌肽、微生物制劑、中藥提取物等新獸藥研發。

枯草芽孢桿菌（B.subtilis）是一類產芽孢，好氧或兼性好氧的革蘭陽性桿狀細菌，是我國農業部允許直接喂養動物的菌種。枯草芽孢桿菌分布廣泛，抗逆性強，一些菌株能產生蛋白酶、脂肪酶等消化酶、合成多種生理活性物質、產生抗菌脂肽、在腸道中奪氧能力強（鄒艷，2017；馬樹瑞等，2016）。 這些優良特性在畜牧養殖業中有利于提高飼料轉化率，促進動物生長發育和提高免疫力，且具無毒副作用、無殘留、原生態等特性。枯草芽孢桿菌及其代謝產物，是理想的抗生素替代物之一 （王宗偉等，2015；鐘蔚，2013），本研究旨在篩選尋找優良的枯草芽孢桿菌，以期將來應用于動物生產。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品、培養基及指示菌 樣品來源：貴州銅仁、貴州赤水、貴州遵義等地土壤、枯葉、動物糞便。

Landy培養基：酵母粉 1 g，L-苯丙氨酸0.002 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀1 g，5水硫酸銅 0.0016 g，7水硫酸鎂 0.5 g，7水硫酸亞鐵0.0015 g，L-谷氨酸 0.5 g， 硫酸錳 0.005 g， 氯化鉀 0.5 g，水 1 L，pH 7。

LB培養基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉 10 g，蒸餾水 1 L，pH 7.2。

纖維素酶檢測培養基：羧甲基纖維素鈉10 g，氯化鈉10 g，蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，水1 L。

PDA培養基：馬鈴薯 200 g（洗凈去皮，稱取200 g馬鈴薯切成小塊，加水煮爛，用八層紗布過濾取濾液），葡萄糖 20 g，瓊脂 15～20 g，水 1 L，自然pH（不加瓊脂則為PD培養基）。

YPD培養基：酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，水 1 L，自然pH。

MRS培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，吐溫80 1 mL，磷酸氫二鉀2 g，乙酸鈉 5 g，檸檬酸銨 2 g，硫酸鎂 0.1 g，硫酸錳0.05 g，蒸餾水 1 L，pH 6.2±0.2。

指示菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（ATCC 25923），大腸桿菌（Escherichia coli）（ATCC 25922），黑曲霉（Aspergillus niger），產朊假單絲酵母（Candida utilis），植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）為本實驗室（民族中獸藥分離純化技術國家地方聯合工程研究中心中獸藥微生物發酵技術研究室）分離純化鑒定保藏。

1.1.2 主要儀器 垂直流超凈工作臺 （ZHJHC1214C），上海智城；pH 計（DELTA 320），上海閔勝；臺式高速冷凍離心機（EXPERT 16K-R），湖南吉爾森；恒溫培養箱（BPH-9042），上海一恒；全自動高壓滅菌鍋（HVE-50），華粵；恒溫震蕩培養箱（DHP260），金壇市國旺試驗儀器廠；安捷倫1100型液相色譜儀；安捷倫G6400三重四極桿質譜聯用儀。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 選取農田、菜園等熟地，取距離泥土表面5～20 cm土壤，或采集枯葉、新鮮動物糞便，裝置于無菌采樣袋中，置于4℃下保藏待用。

1.2.2 菌種分離純化 無菌條件下取采集的樣品，置于滅菌的離心管，加入適量無菌蒸餾水，混勻，置于85～90℃水浴鍋中水浴20 min（或水浴煮沸10 min），冷卻，吸取50μL樣品液涂布于LB固體培養基，37℃下培養24 h，挑取大小、形態不一致的菌落分別繼續劃線培養2次，得純培養菌落，采用25%甘油 -70℃保藏待用。

1.2.3 產抗菌脂肽芽孢桿菌篩選 保藏的菌株，使用適量LB液體培養基活化，活化的菌株劃線培養于LB固態培養基，待長出菌落后，挑取菌落接種于LB液體培養基，37℃下180 r/min振蕩培養15 h作為種子液，種子液按1%比例接種于Landy培養基，37℃下180 r/min振蕩培養24 h，8000 g離心去除菌體，以金黃色葡萄球菌及大腸桿菌為指示菌，采用瓊脂擴散法測試上清液抑菌活性（制備指示菌平板，無菌打孔器打孔后，孔加入80μL上清液，37°C培養18～24 h后測量抑菌圈大小）。

1.2.4 產抗菌脂肽芽孢桿菌分子生物學鑒定 前期篩選得到數株對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有抑制效果的菌株，選擇抑菌效果最好的菌株，編號為S21，菌株S21總DNA提取，16SrDNA擴增和測序由蘇州泓迅生物科技有限公司完成，測序所得的16SrDNA序列校對后，與NCBI的Gen-Bank （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）數據庫和http://www.ezbiocloud.net數據庫分析，根據序列同源性，確定菌株的種屬關系。

1.2.5 枯草芽孢桿菌S21產酶特性

1.2.5.1 蛋白酶 菌株S21使用LB培養基活化，點接種于添加了10%脫脂奶粉的LB培養基，37℃下培養60 h，觀察菌落周圍是否出現蛋白水解圈。

1.2.5.2 脂肪酶 菌株S21活化，點接種于添加了1%三丁酸甘油酯的LB培養基，37℃下培養72 h后觀察菌落周圍是否出現脂肪水解圈。

1.2.5.3 纖維素酶 菌株S21活化，點接種于纖維素酶檢測培養基，37℃下培養48 h后，往平板表面傾入0.1%的剛果紅溶液（蓋住菌落即可），靜置30 min，倒出0.1%的剛果紅溶液，再往平板傾入5%氯化鈉溶液，輕輕搖晃10 min，倒出5%氯化鈉溶液，觀察菌落周圍是否出現透明水解圈。

1.2.5.4 淀粉酶 菌株S21活化，點接種于添加了1%淀粉的LB培養基，37℃下培養48 h后，往平板倒入碘液，觀察菌落周圍是否非藍色圈。

1.2.6 枯草芽孢桿菌21產抗菌脂肽分離純化及鑒定 菌株S21活化，接種于LB培養基作為種子液，種子液按1%比例接種于Landy培養基，37℃下180 r/min振蕩培養30 h，8000 g離心去除菌體得上清液，上清液鹽酸調節pH至2后，4℃靜置過夜，7000 r/min離心得沉淀，沉淀用適量甲醇抽提（調節pH至7），蒸干得殘留物，殘留物加入適量蒸餾水溶解，得粗脂肽提取物。粗脂肽提取物使用半制備液相色譜進行純化，流動相：乙腈（含0.1%三氟乙酸），水（含0.1%三氟乙酸），色譜柱：agilent XDB-C18，波長：214 nm，流速：0.8 mL/min，時間：0～35 min，90%乙腈—90%乙腈。利用安捷倫G6400三重四極桿質譜聯用儀分析半制備色譜純化得到的活性抑菌峰。

1.2.7 抗菌脂肽性質研究

1.2.7.1 抑菌譜 根據1.2.5方法制備得粗脂肽提取物，采用瓊脂擴散法測試其對金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，植物乳桿菌，產朊假單絲酵母，黑曲霉抑制活性（Jagadeeswari等，2010）。具體步驟為：指示菌使用LB培養基 （乳酸菌MRS培養基，霉菌PD培養基，酵母YPD培養基）活化，制備出約107cfu/mL指示菌菌液，相應指示菌固體培養基融化待其溫度降至40℃左右后，按1%比例加入指示菌菌液，混勻倒平板，待平板凝固，打孔器打孔，孔中加入70μL粗抗菌脂肽，37℃下培養24 h后測量抑菌圈直徑。

1.2.7.2 穩定性 熱穩定性，根據1.2.5方法制備得粗脂肽提取物，分別60℃（水浴）、80℃（水浴）、100 ℃（煮沸）、121 ℃（滅菌鍋） 處理 20 min，以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用瓊脂擴散法測試處理后的抗菌脂肽殘留抗菌活性。

酸堿穩定性，根據1.2.5方法制備得粗脂肽提取物，取粗脂肽提取物，采用HCl和NaOH分別調節其 pH 為 2、3、4、5、6、7、8、9、10， 以相應 pH相同的蒸餾水為對照，金黃色葡萄球菌為指示菌，采用瓊脂擴散法測試不同pH下抗菌脂肽的抑菌活性。

2 結果與分析

2.1 產抗菌脂肽芽孢桿菌篩選 利用芽孢桿菌可產生耐高溫芽孢的特性，水浴加熱采集的樣品除去非芽孢類細菌，從銅仁、遵義等地的土壤、枯葉、動物糞便中共篩選到芽孢桿菌200余株，通過是否產抗菌物質篩選，從200余株芽孢桿菌中篩選得到產抗菌物質的芽孢桿菌4株，編號分別為 B1、Y4、S21、20。 其中 S21 對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有抑制效果，其他三株根據篩選的操作方法，其發酵上清液僅僅對金黃色葡萄球菌有抑制效果。故選定編號S21的菌株為進一步研究菌株。

2.2 菌株S21分子生物學鑒定 原核生物的16SrDNA基因含有高度保守序列、中度保守和高度變異序列，可以很好區分種屬關系，且序列長度1500 bp左右，測序方便。故16SrDNA鑒定是目前被最常用來作為細菌鑒定的方法 （楊霞等，2008；劉文強等，2007；焦振泉等，2001）。蘇州泓迅生物科技有限公司對菌株S21總DNA提取，16SrDNA 擴增和測序，使用 seqman（7.1.0）軟件分析，得到1428 bp堿基，在www.ncbi.nlm.nlh.gov網站中使用BLAST在基因庫中進行同源性搜索，所得結果中表明菌株S21與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168（complete genome） （accession number:AL009126.3），Bacillus subtilis strain NCIB 3610 （complete genome）（accession number:CP020102.1） 等 Bacillus subtilis相似度達99%，http://www.ezbiocloud.net進行鑒定，發現與 Bacillus subtilis subsp.Subtilis（NCIB 3610（T））相似度為 99.79%，結合比較結果，鑒定菌株S21為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.3 枯草芽孢桿菌S21產酶特性 枯草芽孢桿菌在代謝過程中能產生多種酶 （劉斯斯等，2017；劉秀俠等，2017；周平等，2016）。 對枯草芽孢桿菌S21的產酶特性定性檢測見圖1。從圖1可以發現，蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶和淀粉酶定性檢測試驗中，枯草芽孢桿菌S21菌落周圍均出現水解圈，說明其產蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶和淀粉酶。

圖1 枯草芽孢桿菌S21產酶特性

2.4 枯草芽孢桿菌S21產抗菌脂肽分離純化及鑒定 枯草芽孢桿菌S21產抗菌脂肽分離純化及鑒定見圖2。粗抗菌脂肽經過半制備色譜純化和抑菌試驗檢測，發現保留時間為15.163 s的峰為活性峰，此活性峰經過ESI-TOF_MS質譜鑒定，可得 到 ＜M+H ＞=1008，＜M-CH2+H ＞=1022，＜M-CH2++H＞=1036 三個加氫離子峰，＜M+Na＞=1030，＜M-CH2++Na＞=1044加鈉離子峰，他們之間的分子量相差 14（即 CH2-），結合文獻資料（李寶慶等，2010；Xiaohong，2008；陳華等，2008），可以推斷出此抗菌脂肽為surfactin族系列物，具體屬于surfactin A系列、surfactin B系列還是surfactin C系列有待進一步分析。

圖2 枯草芽孢桿菌S21產抗菌脂肽分離鑒定圖

2.5 枯草芽孢桿菌S21產抗菌脂肽性質研究枯草芽孢桿菌S21產抗菌脂肽的抑菌性、熱穩定性和酸堿穩定性見表1。從表1可知，枯草芽孢桿菌S21產抗菌脂肽對金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，植物乳桿菌，黑曲霉表現出不同強弱的抑菌活性，但是對產朊假單絲酵母無抑制活性。枯草芽孢桿菌S21產抗菌脂肽能承受一定的溫度，在80°C及以下溫度處理，其活性損失不大，但是對高溫抵抗力比較弱，100°C其活性可損失約達40%。酸堿方面，枯草芽孢桿菌S21產抗菌脂肽在堿性環境下其抑菌活性不受影響，在酸性環境下，其抑菌活性受到一定抑制，但仍然能保留較大活性，總體來說，枯草芽孢桿菌S21產抗菌脂肽熱穩定性和酸堿穩定性較好。

3 討論

Surfactin是芽孢桿菌屬部分菌株代謝產生的一種由七個氨基酸和13～15個碳原子的β羥基脂肪酸鏈組成的環狀抗菌脂肽（莊國宏，2014），研究表明surfactin具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗支原體和原蟲等活性 （翟少偉等，2015；任鵬舉等，2014），在醫藥、農業、食品、環境治理等領域具有巨大的應用前景，特別是在畜牧業中替代抗生素，具有非常好的潛力。

動物飼料中添加各種酶有利于動物生產，因為酶可以幫助消化飼料，提升飼料報酬，故酶制劑在動物生產中應用廣泛 （高研等，2017；高研等，2016a； 高研等，2016b；孫玉明等，2016），利用飼用益生菌本身產酶特性，制備微生態制劑，在動物消化也可起到重要作用。

本研究篩選到一株能產對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有抑制效果抗菌脂肽的芽孢桿菌，經過分子生物學鑒定為枯草芽孢桿菌，進一步研究表明枯草芽孢桿菌S21產surfactin，且產蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶，其產生的抗菌脂肽抑菌譜廣、熱穩定性和酸堿穩定性較好，說明枯草芽孢桿菌S21是一株性能優良的菌株，能夠用于動物養殖，比如作為微生態制劑、發酵飼料和飼用抗菌脂肽生產菌種。

表1 枯草芽孢桿菌S21產抗菌脂肽性能