抗菌肽與喹乙醇體外抑菌效果的比較及對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響

張 江， 劉揚(yáng)科， 張俊輝， 張 琳， 巢麟鋒， 熊海濤

（1.北京中農(nóng)穎泰生物技術(shù)有限公司，北京100193；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京100193；3.林州中農(nóng)穎泰生物肽有限公司，農(nóng)業(yè)部飼用抗生素替代技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南林州456550；4.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430070）

喹乙醇屬于喹噁啉類抗生素，對(duì)于緩減仔豬斷奶腹瀉，促進(jìn)生長(zhǎng)具有明顯的作用。然而，喹乙醇具有明顯的蓄積毒性，長(zhǎng)期超量添加，存在潛在的三致性，即致畸形，致突變，致癌。根據(jù)農(nóng)業(yè)部2017年12月6日《關(guān)于停止喹乙醇、氨苯胂酸、洛克沙胂用于食品動(dòng)物的公告》，2019年5月1日停止喹乙醇用于食品動(dòng)物。故尋找喹乙醇的替代方案具有重要的理論和實(shí)際意義。目前，作為潛在的抗生素替代品，抗菌肽、微生態(tài)、酶制劑、植物提取物成為現(xiàn)階段重要的研究對(duì)象。

抗菌肽是具有抗菌活性的一類短肽，廣泛地存在于生物界，其是機(jī)體先天免疫系統(tǒng)的重要成分，構(gòu)成宿主防御病原微生物入侵的第一道屏障（魏艷彬，2009；Haug，2007）。 腸桿菌肽是在腸道微生物發(fā)現(xiàn)的一種抗菌肽（RauL，1992），其具有很強(qiáng)的抑制大腸桿菌和沙門氏菌的作用（Maria，2001）。腸桿菌肽是由21個(gè)氨基酸組成的套索肽，分子質(zhì)量為2.1 kDa，其中N端的8個(gè)氨基酸形成一個(gè)圓形的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，9～21氨基酸形成β發(fā)夾結(jié)構(gòu)，貫穿圓環(huán)，故其性質(zhì)非常穩(wěn)定，對(duì)高溫、蛋白酶有良好耐受性（Marvin，2003）。腸桿菌肽對(duì)大腸桿菌最低抑菌濃度為0.2～1μg/mL（Marvin，2003）， 遠(yuǎn)低于喹乙醇 12.5 ～ 50 μg/mL（朱慶義，1998），其對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的抑制殺滅能力好于喹乙醇。本試驗(yàn)在斷奶仔豬日糧中添加抗菌肽腸桿菌肽替代原配方中的喹乙醇，研究其對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響，旨在為抗菌肽替代喹乙醇提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 抗菌肽腸桿菌肽 （抗菌肽含量0.5%），林州中農(nóng)穎泰生物肽有限公司提供。50%喹乙醇（中牧股份），市場(chǎng)購買。

菌株：大腸桿菌ATCC25922，沙門氏菌CVCC50094，金黃色葡萄球菌ATCC25923。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 指示菌菌懸液的準(zhǔn)備 細(xì)菌復(fù)蘇：指示菌菌種均平板劃線，37℃培養(yǎng)20 h；挑取單菌落于MH液體培養(yǎng)基，置37℃振蕩培養(yǎng)12～14 h。用生理鹽水將菌液稀釋至OD600吸光值為0.1（約108cfu/mL）。

1.2.2 抗菌肽腸桿菌肽的處理 先配制產(chǎn)品原液，稱取1.28 g樣品定容于100 mL提取液（配制方法：量取400 mL超純水，加入58.44氯化鈉搖晃至溶解，然后向其中加入500 mL無水乙醇充分混勻，再向溶液中加超純水定容至1000 mL，并用NaOH調(diào)節(jié)pH=7.5～8.0），制成12800μg/mL的樣品液，振蕩混合均勻。吸取適量上述溶液于具塞滅菌離心管中，5000 r/min離心2 min，取上清液于0.22μm濾膜過濾，取過濾液，將前面過濾的1 mL左右液體棄去，收集后面過濾的液體，備用。

喹乙醇處理方法同上，其樣品溶于無菌水，其他操作相同。

1.2.3 抑菌試驗(yàn) 根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì) （CLSI，2009）推薦的微量稀釋法參考方案（M27-A8）測(cè)定抗菌藥物對(duì)指示菌株的MIC值，接種菌量為5×105cfu／mL，具體方法：用微量加液器取50μL培養(yǎng)基加入96孔板1～11孔，第12孔100μL然后在第一孔中加入50μL實(shí)驗(yàn)藥物，依次進(jìn)行兩倍稀釋，腸桿菌肽濃度為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL，其產(chǎn)品依次為 6400、3200、1600、800、400、200、100、50、25、12.5 μg/mL，然后加入50μL細(xì)菌懸液，則濃度依次為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 、0.0625 μg/mL， 其產(chǎn) 品 依 次 為 6400、3200、1600、800、400、200、100、50、25、12.5、6.25 μg/mL， 微量板 37 ℃培養(yǎng)16 h觀察結(jié)果。

1.2.4 試驗(yàn)動(dòng)物及設(shè)計(jì) 試驗(yàn)挑選8欄健康的平均斷奶28日齡左右、斷奶方式一致、平均斷奶體重7.0 kg左右的仔豬，分為2個(gè)處理組，分別為喹乙醇組、抗菌肽組，每個(gè)處理組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)18～19頭。保證各處理間初始體重?zé)o明顯差異。試驗(yàn)前3天保健，不使用抗生素等藥物，試驗(yàn)期為10 d。試驗(yàn)用基礎(chǔ)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。各個(gè)處理組日糧中藥物添加見表2。

試驗(yàn)豬在斷奶前按豬場(chǎng)的正常飼養(yǎng)管理規(guī)定進(jìn)行飼養(yǎng)和免疫。試驗(yàn)期間自由采食，同時(shí)提供充足潔凈的飲水。圈舍內(nèi)溫度控制在23～25℃，每天做圈舍清掃，每周進(jìn)行豬場(chǎng)消毒，疾病的防治與保健豬場(chǎng)實(shí)際情況進(jìn)行。

表1 基礎(chǔ)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平

表2 各處理組日糧藥物添加方案

1.2.5 檢測(cè)指標(biāo)與方法 記錄每欄初重、末重、飼料消耗量，每天記錄每欄采食量折算每頭日采食量，每日上午和下午喂料時(shí)各觀察統(tǒng)計(jì)一次并做好記錄每欄腹瀉豬頭數(shù)。

日增重/（g/d）=（試驗(yàn)?zāi)┛傊?試驗(yàn)期死亡/淘汰的動(dòng)物總重-試驗(yàn)初總重）/試驗(yàn)頭日數(shù)，其中試驗(yàn)頭日數(shù)應(yīng)包括淘汰的豬試驗(yàn)天數(shù)內(nèi)。

料重比=總耗料/總增重；

腹瀉率/%=（腹瀉頭數(shù)×腹瀉天數(shù)）/（試驗(yàn)豬頭數(shù)×試驗(yàn)天數(shù)）×100；

大腸桿菌計(jì)數(shù)：采用梯度稀釋法，將糞便溶于無菌水中，涂布于麥康凱瓊脂（北京陸橋技術(shù)股份有限公司），計(jì)數(shù)顯金屬光澤的紫色菌落數(shù)；

乳酸菌：采用梯度稀釋法，將糞便溶于無菌水中，涂布于MRS瓊脂（北京陸橋技術(shù)股份有限公司），厭氧培養(yǎng)，菌落計(jì)數(shù)；

總好氧菌：采用梯度稀釋法，將糞便溶于無菌水中，涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂（北京陸橋技術(shù)股份有限公司），菌落計(jì)數(shù)；

總厭氧菌：采用梯度稀釋法，將糞便溶于無菌水中，涂布于EG瓊脂培養(yǎng)基（上海康朗生物科技有限公司），菌落計(jì)數(shù)；

仔豬皮毛指數(shù)：試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)仔豬的外觀進(jìn)行逐頭評(píng)分，具體方法見表3。

皮毛指數(shù)=皮膚紅潤(rùn)程度+毛色亮度+毛順程度。

表3 仔豬外觀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0分析軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽腸桿菌肽與喹乙醇對(duì)不同菌株最低抑菌濃度的比較 由表4可知，以大腸桿菌ATCC25922為指示菌株，0.5%腸桿菌肽與50%喹乙醇最低抑菌濃度均為400μg/mL，而相對(duì)于沙門氏菌CVCC50094，0.5%腸桿菌肽的最低抑菌濃度為200μg/mL，低于50%喹乙醇最低抑菌濃400μg/mL。腸桿菌肽對(duì)革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌無抑菌作用。

2.2 抗菌肽腸桿菌肽替代硫酸黏桿菌素和喹乙醇對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響 抗菌肽腸桿菌肽替代喹乙醇對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能和腹瀉率的影響見表5。同喹乙醇組相比，抗菌肽組日增重提高了3.1%、采食量提高了2.9%（P＞0.05）、料肉比相同，腹瀉率降低，整個(gè)試驗(yàn)期無仔豬死亡。

表4 腸桿菌肽與喹乙醇對(duì)不同菌株最低抑菌濃度的比較μg/mL

表5 抗菌肽替代硫酸黏桿菌素和喹乙醇對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能和腹瀉率的影響

2.3 抗菌肽替代硫酸黏桿菌素和喹乙醇對(duì)斷奶仔豬糞便菌群和皮毛指數(shù)的影響 表6結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，腸桿菌肽的添加能明顯降低腸道中大腸桿菌的數(shù)量（P＜0.05），但對(duì)于乳酸菌數(shù)和總好氧菌數(shù)沒有影響。使用腸桿菌肽組的皮毛好于喹乙醇組，差異顯著（P＜0.05）。

表6 抗菌肽替代硫酸黏桿菌素和喹乙醇對(duì)斷奶仔豬糞便菌群和皮毛指數(shù)的影響

3 討論

傳統(tǒng)抗生素的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用為治療感染性疾病提供了非常有效的途徑，也顯著提高了動(dòng)物食品產(chǎn)品的數(shù)量。盡管目前抗生素治療仍然是應(yīng)對(duì)人類及動(dòng)物微生物感染的首選方法，但是，細(xì)菌對(duì)傳統(tǒng)抗生素耐藥性的產(chǎn)生已經(jīng)引起越來越多公眾對(duì)健康問題的關(guān)注，驅(qū)使科學(xué)家們開始尋找安全的新型抗菌劑。抗菌肽分子量小、水溶性好、熱穩(wěn)定性較高、生物功能多樣，有著與傳統(tǒng)抗生素不同的殺菌機(jī)制，不易導(dǎo)致耐藥性菌株的產(chǎn)生。目前發(fā)現(xiàn)的抗菌肽已達(dá)到兩千多種，不同種類抗菌肽的抗菌譜、抗菌活性、作用機(jī)制存在很大的差異（McPhee，2005；Blazyk，2001）。

腸桿菌肽是一種新型抗菌肽，許多研究表明，腸桿菌肽對(duì)革蘭氏陰性菌如大腸桿菌和沙門氏菌有極其良好的殺滅作用。Sophie等（2000）研究發(fā)現(xiàn)，腸桿菌肽純品對(duì)E.coli O157:H7最低抑菌濃度為1μg/mL。Fabian等（2007）研究顯示，其對(duì)沙門氏菌最低抑菌濃度為3.12μg/mL，這些研究都表明，腸桿菌肽對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌具有很強(qiáng)的抑菌效果。目前，一些學(xué)者認(rèn)為腸桿菌肽是通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜和抑制RNA轉(zhuǎn)錄這兩種機(jī)理來抑制大腸桿菌和沙門氏菌（Maria，2001）。本試驗(yàn)以大腸桿菌ATCC25922、沙門氏菌CVCC50094以及金黃色葡萄球菌ATCC25923為指示菌，測(cè)定腸桿菌肽和50%喹乙醇的最低抑菌濃度發(fā)現(xiàn)，以大腸桿菌ATCC25922為指示菌株，0.5%腸桿菌肽與50%喹乙醇最低抑菌濃度均為400μg/mL，而相對(duì)于沙門氏菌CVCC50094，0.5%腸桿菌肽的最低抑菌濃度為200μg/mL，低于50%喹乙醇最低抑菌濃400μg/mL。腸桿菌肽對(duì)革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌無抑菌作用。結(jié)果表明，針對(duì)大腸桿菌ATCC25922，0.5%腸桿菌肽與50%喹乙醇抑菌能力相當(dāng)，而針對(duì)沙門氏菌，0.5%腸桿菌肽的抑菌能力要優(yōu)于50%喹乙醇。

研究結(jié)果顯示，抗菌肽可替代抗生素類飼料添加劑在豬、雞、鴨等動(dòng)物上使用（陳曉生，2005；馬為明，2004；溫劉發(fā)，2001）。 孫何軍等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，蛋雞日糧中加入腸桿菌肽可以提高蛋雞生產(chǎn)性能，提高效益。在本試驗(yàn)條件下，在斷奶階段，日糧中添加腸桿菌肽可以替代喹乙醇，替代后生產(chǎn)性能及腹瀉率不受影響，腸道中的大腸桿菌數(shù)量相對(duì)于喹乙醇組顯著降低，乳酸菌數(shù)有所提高，大腸桿菌是埃希氏大腸桿菌的某些血清致病型所引起的多種疾病的總稱，可引起畜禽敗血癥、腸炎性、泄殖腔炎等疾病，而乳酸菌作為人和動(dòng)物腸道的正常菌群，具有許多的益生特性，其能維持動(dòng)物腸道菌群平衡，促進(jìn)動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高動(dòng)物機(jī)體的免疫力等。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，針對(duì)腸道菌群，腸桿菌肽組優(yōu)于喹乙醇組，抗菌肽腸桿菌肽可以作為潛在的抗生素替代品在動(dòng)物生產(chǎn)中應(yīng)用。