三七總皂苷與淫羊藿總黃酮聯合對自然衰老大鼠睪丸生殖功能衰退的影響

杜麗娜 王超 王芳

摘要：目的 觀察三七總皂苷（PNS）與淫羊藿總黃酮（TFE）聯合對自然衰老大鼠睪丸生殖功能衰退的影響，探討其作用機制。方法 將30只18月齡SD大鼠隨機分為自然衰老組和PNS+TFE低、高劑量組，每組10只。另取10只2月齡大鼠為青年對照組。PNS+TFE低、高劑量組大鼠分別給予10 mg/kg PNS、TFE和20 mg/kg PNS、TFE灌胃，自然衰老組和青年對照組大鼠給予生理鹽水灌胃。每周連續給藥6 d，共4個月。末次給藥后24 h，大鼠稱重后處死，取睪丸組織，稱取質量，計算睪丸指數。HE染色觀察睪丸組織形態，TUNEL法檢測大鼠生殖細胞凋亡，Western blot檢測睪丸組織抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax和DNA損傷蛋白γ-H2AX的表達。結果 與自然衰老組比較，PNS+TFE低、高劑量組衰老大鼠睪丸質量和睪丸指數均明顯升高，生精小管組織形態明顯改善，睪丸生精細胞凋亡數量明顯減少，睪丸組織Bcl-2蛋白表達顯著上調，Bax和γ-H2AX蛋白表達顯著下調，Bax/Bcl-2比值降低。結論 PNS與TFE聯合給藥可延緩自然衰老大鼠生殖功能衰退，其機制可能與抑制睪丸生殖細胞的凋亡和DNA損傷有關。

關鍵詞：三七總皂苷；淫羊藿總黃酮；衰老；凋亡；DNA損傷；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.008

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）09-0031-04

Abstract： Objective To investigate the effects of panax notoginseng saponins （PNS） combined with total flavonoids from epimedium （TFE） on testicular dysfunction in natural aging rats； To discuss its mechanism of action. Methods Thirty 18-month old male SD rats were randomly divided into natural aging group， PNS combined with TFE low and high dose groups， with 10 rats in each group. Another 10 2-month old rats were set as young control group. PNS combined with TFE low and high dose groups were given gastric gavage of 10 mg/kg PNS combined with 10 mg/kg TFE， and 20 mg/kg PNS combined with 20 mg/kg TFE， respectively. Rats in young control group and natural aging group were given saline for 6 d each week， lasting for 4 months. Then， rats were sacrificed， and the testes were obtained to calculate the testicular weight and the testicular index. The testicular tissue morphology was observed by using HE staining. Testicular germ cell apoptosis was detected by using TUNEL method. The levels of Bcl-2， Bax and γ-H2AX protein expression in testicular tissue were detected by Western blot. Results Compared with natural aging group， low and high dose of PNS combined with TFE significantly elevated the testicular weight and testicular index， improved the histological changes of testicular seminiferous tubule， significantly reduced number of apoptosis of spermatogenic cells in the testis， upregulated the expression of Bcl-2 protein in the testis， downregulated the expression of Bax and γ-H2AX protein， and decreased the ratio of Bax/Bcl-2. Conclusion PNS combined with TFE can improve testicular dysfunction in natural aging rats by inhibiting apoptosis and DNA damage of germ cells.

Keywords： panax notoginseng saponins； total flavonoids from epimedium； aging； apoptosis； DNA damage； rats

三七為五加科人參屬植物，其根莖入藥。現代藥理研究顯示，三七有延緩衰老和保護生精功能等作用[1]，其中三七總皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）是三七的主要活性成分。淫羊藿是我國傳統的補腎壯陽中藥，以單味或復方入藥，應用于性功能低下及睪丸病變，有補腎陽、抗睪丸衰老的功效，其中淫羊藿總黃酮（total flavonoids from epimedium，TFE）是淫羊藿的主要成分。現代藥理研究顯示，PNS有清除自由基、提高免疫力、拮抗睪丸炎癥損傷、抑制細胞凋亡等作用[2]；TFE有增強性腺功能、延緩衰老、抗腫瘤等作用[3]。但二者聯合給藥是否可改善睪丸生殖功能衰退鮮有報道。因此，本實驗以自然衰老大鼠為模型，觀察PNS與TFE聯合對自然衰老大鼠睪丸生殖功能衰退的影響，探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

雄性SD大鼠，2月齡10只，體質量（220±30）g，18月齡30只，體質量（500±50）g，均為SPF級，北京維利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2012-0001。飼養于三峽大學醫學院SPF級動物房，溫度（23±3）℃，相對濕度（60±5）%，12 h明暗交替，自由攝食飲水。本實驗遵循國家有關實驗動物保護與使用的準則。

1.2 藥物

PNS，成都植標化純生物技術有限公司，純度>95%；TFE，成都仁誠生物科技有限公司，質量分數80%。

1.3 主要試劑與儀器

β-Actin抗體（批號66009-1-lg），美國Proteintech公司；促凋亡蛋白Bax抗體（批號ab182733）、抗凋亡蛋白Bcl-2抗體（批號ab59348），美國Abcam公司；DNA損傷相關蛋白γ-H2AX抗體（批號SC-101696），美國Santa Cruz公司；二抗驢抗兔，美國Jackson Immuno Research公司；超敏ECL顯影液，上海碧云天生物技術有限公司；TUNEL試劑盒，瑞士Roche公司；苯甲基黃酰氟（PMSF）、RIPA裂解液、磷酸蛋白酶抑制劑，武漢谷歌生物有限公司；BCA蛋白定量試劑盒，北京普利萊基因技術有限公司。CS-V1型攤片烤片機，孝感市宏業醫用儀器有限公司；1X53顯微鏡，日本Olympus公司；PowerPacTM Basic電泳儀、Mini Protean3 Cell電泳槽及蛋白電泳技術平臺，美國Bio-Rad公司；Bioshine ChemiQ4800化學發光凝膠成像自動顯影儀，上海歐翔科學儀器有限公司；Leica TP1020自動脫水機、Leica EG1150H石蠟包埋機、Leica EG1150C超薄切片機，德國Leica公司。

2 實驗方法

2.1 分組及給藥

將30只18月齡SD大鼠隨機分為自然衰老組和PNS+TFE低、高劑量組（中藥低、高劑量組），每組10只，另取10只2月齡大鼠為青年對照組。中藥低劑量組予10 mg/kg PNS、TFE灌胃，中藥高劑量組予20 mg/kg PNS、TFE灌胃，自然衰老組和青年對照組予生理鹽水灌胃。給藥體積均為1 mL/100 g，每周連續給藥6 d，周日不給藥，共4個月。末次給藥24 h后，大鼠稱重，麻醉處死，取出睪丸組織稱重，計算睪丸指數[睪丸質量（mg）÷體質量（g）]。

2.2 HE染色

睪丸組織稱重后，切取部分睪丸組織，4%多聚甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋，切片（厚度5 μm），HE染色，中性樹脂封片。光學顯微鏡下觀察大鼠睪丸組織形態。

2.3 TUNEL法檢測大鼠睪丸組織細胞凋亡

組織常規脫蠟，按照TUNEL試劑盒說明書操作，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察大鼠睪丸組織細胞凋亡情況，棕黃色細胞即為凋亡細胞。

2.4 Western blot檢測大鼠睪丸組織Bax、Bcl-2和γ-H2AX蛋白表達

稱取所需睪丸組織50～100 mg置于1.5 mL EP管內，加入1 mL PBS，冰上充分剪碎，3500 r/min離心5 min，棄上清液，重復多次至上清液無色。按RIPA∶PMSF∶蛋白磷酸酶抑制劑A∶蛋白磷酸酶抑制劑B為100∶1∶1∶1的比例加入350 μL裂解液裂解25 min。12 000 r/min離心10 min后取上清液，加入5×上樣緩沖液，95 ℃煮沸10 min，使蛋白變性。等體積上樣，SDS-PAGE凝膠電泳并恒流轉PVDF膜后，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，TBST清洗3次，每次10 min。超敏ECL顯影液A∶B=1∶1配制顯影液，ECL化學發光顯影，圖像分析系統ImagePro Plus 6.0掃描其灰度值，GraphPad Prism軟件進行數據分析。

3 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示。采用方差分析，組間比較用Dunnett't檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 三七總皂苷與淫羊藿總黃酮聯合對自然衰老大鼠睪丸質量與睪丸指數的影響

與青年對照組比較，自然衰老組大鼠睪丸質量和睪丸指數顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05）；與自然衰老組比較，中藥低、高劑量組大鼠睪丸質量、睪丸指數顯著上升，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表1。

4.2 三七總皂苷與淫羊藿總黃酮聯合對自然衰老大鼠睪丸組織形態學的影響

青年對照組大鼠睪丸組織生精小管上皮稍厚，生精小管內各層次細胞層數分明，排列緊密，核質分明，可見各級生精細胞；自然衰老組大鼠睪丸組織中生精小管上皮變薄，細胞數目較青年對照組明顯減少，細胞層數明顯減少，排列紊亂，各級生精細胞數目減少；與自然衰老組比較，中藥低、高劑量組大鼠上述情況明顯改善，睪丸組織生殖細胞層次和各級生精細胞呈劑量依賴性增加。結果見圖1。

4.3 三七總皂苷與淫羊藿總黃酮聯合對自然衰老大鼠睪丸組織細胞凋亡的影響

與青年對照組比較，自然衰老組大鼠睪丸組織凋亡細胞數目明顯增多，且主要表達于精原細胞和初級精母細胞；與自然衰老組比較，中藥低、高劑量組大鼠睪丸組織凋亡細胞數量明顯減少。結果見圖2。

4.4 三七總皂苷與淫羊藿總黃酮聯合對自然衰老大鼠睪丸組織Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

與青年對照組比較，自然衰老組大鼠睪丸組織Bax蛋白表達顯著上調，Bcl-2蛋白表達顯著下調，Bax/Bcl-2比值顯著上調，差異有統計學意義（P<0.05）；與自然衰老組比較，中藥低、高劑量組大鼠睪丸組織Bax蛋白表達顯著下調，Bcl-2蛋白表達顯著上調，Bax/Bcl-2比值顯著下調，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表2、圖3。

4.5 三七總皂苷與淫羊藿總黃酮聯合對自然衰老大鼠睪丸組織DNA損傷相關蛋白γ-H2AX表達的影響

與青年對照組比較，自然衰老組大鼠睪丸組織γ-H2AX表達顯著上調，差異有統計學意義（P<0.05）；與自然衰老組比較，中藥低、高劑量組γ-H2AX表達顯著下調，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表3、圖4。

5 討論

衰老是隨年齡增長機體逐漸出現退行性變化的過程，表現為生物體內各部分器官系統功能的逐漸衰退。隨著男性年齡的增加，精液參數及精子功能明顯下降，妊娠等待時間明顯延長。本實驗結果顯示，PNS和TFE聯合給藥后自然衰老大鼠的睪丸質量與睪丸指數顯著升高，生精細胞層數和數目明顯增加，各級生精細胞均有不同程度的恢復，提示PNS和TFE聯合給藥對自然衰老大鼠睪丸生殖功能衰退具有一定的保護作用。

細胞凋亡是細胞在基因控制下的程序化死亡，與衰老過程中器官功能的退化、衰老相關疾病的發展密切相關。有研究報道，衰老過程中逐漸增加的凋亡細胞會誘發雄性哺乳動物生精細胞凋亡增加，使精子數量減少，從而導致生殖功能減退[4]。本實驗結果顯示，PNS和TFE聯合可明顯降低衰老大鼠睪丸組織凋亡細胞數量。已知Bcl-2基因家族與凋亡密切相關，Bcl-2對細胞凋亡起抑制作用，Bax作為Bcl-2基因家族中的一員，對細胞凋亡起促進作用，Bax/Bcl-2比值對細胞的存亡起著決定性作用。本實驗結果顯示，Bcl-2蛋白表達在自然衰老大鼠睪丸組織中顯著降低，而Bax蛋白表達顯著升高。PNS和TFE聯合可顯著升高Bcl-2蛋白表達，降低Bax蛋白表達。表明聯合給藥可有效改善衰老大鼠睪丸組織細胞凋亡。

DNA損傷導致的細胞凋亡是衰老公認機制之一，而磷酸化的γ-H2AX與DNA雙鏈斷裂關系密切[5-6]。γ-H2AX是DNA損傷標記物，可反映DNA損傷和細胞凋亡與衰老的程度。本實驗結果顯示，自然衰老大鼠睪丸組織γ-H2AX蛋白表達顯著升高，而PNS和TFE聯合可顯著下調大鼠睪丸組織γ-H2AX蛋白表達。表明聯合給藥可有效拮抗衰老大鼠睪丸組織DNA損傷，從而抑制生殖細胞的凋亡。

綜上所述，PNS和TFE聯合給藥對自然衰老大鼠睪丸生殖功能衰退有明顯的保護作用，其機制可能與抑制DNA損傷相關蛋白γ-H2AX和生殖細胞凋亡有關。但其具體機理尚未明確，仍需進一步研究探討，為臨床研究男性睪丸的衰老提供更加明確的實驗依據。

參考文獻：

[1] 鐘曉鳳.三七的藥理作用及其臨床應用研究[J].中醫臨床研究，2015， 9（6）：116-117.

[2] 劉靜，張長城，韓貴芳，等.三七總皂苷對自然衰老大鼠睪丸炎癥反應和生殖細胞凋亡的影響[J].中藥新藥與臨床藥理，2016，27（5）：644- 649.

[3] 宋來新，趙海霞，袁丁，等.淫羊藿總黃酮對自然衰老大鼠睪丸細胞凋亡及p-P53、p-P38表達的影響[J].中藥材，2016，39（10）：2347-2350.

[4] JIANG H， ZHU W J， LI J， et al. Quantitative histological analysis and ultrastructure of the aging human testis[J]. Int Urol Nephrol， 2014，46（5）：879-885.

[5] 余應年.DNA鏈斷裂與DNA損傷和細胞凋亡[J].癌變·畸變·突變， 1999，8（6）：280.

[6] 黃鵬程，周長慧，常艷.基于γ-H2AX生物標志物DNA遺傳毒性檢測方法的研究進展[J].中國新藥雜志，2016，25（4）：418-424.

（收稿日期：2018-02-27）

（修回日期：2018-03-26；編輯：華強）