69株雞白痢沙門氏菌的分離鑒定及耐藥性分析

劉洋 ，嚴專強 ，王占新 ，潘海萍 ，陳倫鋒 ， 嚴麗端 ，覃健萍 ，魯俊鵬 *

（1.廣東溫氏食品集團股份有限公司，廣東 新興 527439；2.廣東溫氏南方家禽育種有限公司，廣東 新興 527439）

雞白痢沙門氏菌具有高度適應專一宿主的特點，禽類中雞最易感，可引起雛雞的急性敗血癥，多侵害3周齡以內幼雛，發病率和病死率極高；隨著日齡增加對本病的抵抗力迅速上升，成年雞亦可被感染，常導致母雞產蛋減少，生殖道畸形，體質量下降，也導致孵化率和出雛率明顯下降，雞白痢是危害養雞業發展的重要疾病之一[1，2]。本試驗在2017～2018年期間從廣東地區多個大型種雞場采集樣品進行雞白痢沙門氏菌分離鑒定，對分離菌株進行了部分藥物的耐藥性分析，以期初步了解廣東區域雞白痢沙門氏菌流行動態和耐藥性情況，為獸醫工作者在雞白痢的防治提供參考依據，為進一步控制和凈化雞白痢沙門氏菌奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、胰蛋白胨大豆肉湯培養基（TSB）、沙門氏菌屬顯色培養基、XLT4瓊脂培養基、藥敏紙片包括氨芐西林、氯霉素、鏈霉素、四環素、環丙沙星、磺胺異惡唑甲氧氨芐嘧啶、甲氧氨芐嘧啶和萘啶酸均購自環凱微生物科技有限公司；Ex Taq酶購自TAKARA。

1.2 病原和細菌分離 無菌取死胚的卵黃囊、弱雛雞的肝臟，無菌剪碎后分別接至亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）增菌，再取一環劃線接種于沙門氏菌屬顯色培養基和XLT4培養基，進行沙門氏菌的分離鑒定。

1.3 革蘭氏染色鏡檢 挑取純化好的單菌落置于胰蛋白胨大豆肉湯，培養過夜。將菌液涂片固定后，再按結晶紫初染1min、碘液媒染1min、酒精脫碘30s、蕃紅復染1min的步驟依次進行革蘭氏染色操作，待玻片干燥后在顯微鏡下觀察分離菌株的形態特征。

1.4 生化鑒定 取適量菌液分別接種于沙門氏菌的生化鑒定管中（三糖鐵、蛋白胨水、尿素、氰化鉀、賴氨酸脫羧酶、甘露醇、山梨醇、β半乳糖苷、衛矛醇），24h后觀察并記錄結果。

1.5 PCR擴增 根據GenBank已經公布的雞白痢沙門氏菌ipaJ基因的保守核苷酸序列設計的雞白痢沙門氏菌的特異性引物進行PCR擴增[3]，20μl反應體系：Ex Taq 酶 10μl，無菌水 8μl，上下游引物各 0.5μl，菌液1μl。PCR反應程序95℃預變性 5min；94℃變性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸30s，30循環；72℃后延伸10min。將PCR產物進行電泳檢測，擴增產物目的片段為161bp。

1.6 藥敏試驗 采用藥敏片法對8種抗菌藥物進行藥敏試驗，以測定菌株對抗菌藥物的敏感性和不同菌株之間的差異。

2 結果與分析

2.1 分離菌株形態 在顯色瓊脂培養基上形成圓形、光滑凸起的紫紅色菌落，XLT4瓊脂培養基上長出圓形、無色透明的菌落；經革蘭氏染色后顯微鏡觀察，分離的細菌為革蘭氏陰性、兩端鈍圓短桿菌。

2.2 生化鑒定和PCR鑒定結果 生化試驗結果表明，這69個分離株在三糖鐵瓊脂（TSI）試驗中均產酸、斜面變紅，蛋白胨、尿素、氰化鉀、山梨醇、衛矛醇和β-半乳糖苷酶均為陰性，賴氨酸脫羧酶陽性，其中14個分離株表現為甘露醇陰性，其余分離株均為陽性，參照生化鑒定試劑盒的說明書進行判斷，69個分離株均為沙門氏菌，將其進行雞白痢的特異性PCR，69個分離株均能擴增出目的片段。

2.3 藥敏試驗結果 69株沙門氏菌對8種藥物的敏感性見下表1所示。由表1可知，50個分離株表現出多重耐藥，69株受試菌株均對環丙沙星表現出敏感，10.14%的菌株對氯霉素耐藥，24.64%的菌株對四環素耐藥，28.99%的菌株對鏈霉素耐藥，57.97%的菌株對氨芐西林耐藥，62.32%的菌株對萘啶酸耐藥，71.01%的菌株對甲氧氨芐嘧啶耐藥，72.46%的菌株對磺胺異惡唑甲氧氨芐嘧啶耐藥。

3 討論

雞白痢是一種急性的系統性疾病，可引起種蛋受精率、孵化率和健苗率降低及死胚率、弱胚率和弱雛率升高等，給養禽業造成了巨大的損失。但是目前預防雞白痢沙門氏菌并無有效的疫苗，只能通過淘汰陽性雞和用藥來控制[4]。因此，需要種雞場嚴格遵守定期檢疫淘汰制度，淘汰感染雞，做好種雞場的凈化、種蛋消毒、加強雛雞飼養管理、藥物防控和衛生措施等環節，保持雞舍干燥、清潔，切斷水平傳播和垂直傳播。

本研究在2017～2018年期間成功在廣東地區分離出69株雞白痢沙門氏菌。藥敏試驗發現這69個分離株對8種藥物的敏感性具有差異，其中所有受試菌株僅對環丙沙星表現出極度敏感，其他分離株均表現出不同程度的耐藥和多重耐藥，同一地區分離株之間也具有差異。這與其他關于雞白痢沙門氏菌的抗菌藥物耐藥結果類似[5-7]。因此，在臨床用藥預防和治療某種疾病時，臨床用藥必須結合藥敏試驗進行輪換用藥和聯合用藥。當然，藥物防控是不得已而為之，最重要的還是加強雞場的飼養管理，定期監測、淘汰疑似陽性雞，逐步凈化雞群，提高雞群健康度。

表1 分離株藥敏試驗結果