PKM2、ENO1和VEGF在河湟谷地胃腺癌患者中的表達及意義

于鵬杰 張成武 燕 速 馬新福 王煥麗

(青海大學附屬醫院腫瘤外科一(胃腸)，青海 西寧 810001)

胃癌是全球第四位最常見惡性腫瘤，其死亡率居全球癌癥死亡譜的第2位〔1〕。胃腺癌是發生于中老年人的常見腫瘤，起源于胃黏膜表面的上皮，其形成與飲食、環境、幽門螺旋桿菌(Hp)感染及機體的免疫力等有關。胃腺癌形成前黏膜上皮的異型增生是其前期病變。胃癌的發病率及死亡率在歐美等國呈現下降趨勢〔2〕，但是在亞洲尤其是中國的西北地區胃癌的發病率及死亡率仍然呈現較高水平。河湟谷地是指我國青藏高原達坂山與積石山之間，黃河上游與湟水河流域在青海省境內東部地區形成的肥沃三角地帶，是青海省主要的農業區，前期研究顯示〔1,2〕，該地區是我國胃癌高發區及高死亡率地區之一，而且胃癌的發生及發展呈現不同的生物學行為，如該地區胃癌的發生與慢性胃病背景，Hp感染率高及遺傳等因素有關，具有高侵襲性；進展期胃癌以低中分化腺癌為主，易發生淋巴結轉移及神經脈管侵犯等。腫瘤形成時涉及多種基因和蛋白的異常表達，并促進病變進展〔2〕。丙酮酸激酶是糖酵解過程中的限速酶，能對磷酸烯醇式丙酮酸進行催化，轉變成丙酮酸，繼而產生能量。丙酮酸激酶共有4種同工酶，其中丙酮酸激酶同工酶(PK)M2是重要的酶，其不僅催化作用明顯，在腫瘤的進展中還具有重要的調節作用〔3〕。烯醇酶(ENO)1作為糖酵解途徑的關鍵酶和多功能蛋白，可以促進腫瘤細胞的增殖和轉移。研究顯示ENO1可能對血管內皮生長因子(VEGF)有一定的調節作用〔4〕。本實驗對胃腺癌中PKM2、ENO1和VEGF的表達特征進行觀察，分析其意義。

1 材料和方法

1.1臨床資料 2015年2月至2016年2月在青海大學附屬醫院確診為胃腺癌并行根治術的患者102例為觀察組，年齡35～86歲，平均(59.9±13.4)歲，其中男53例，女49例。納入標準：①符合WHO中胃腺癌的標準及分型；②首次確診；③患者或家屬均簽署知情同意書。排除標準：①術前放、化療；②有消化系統手術史；③伴有其他器官惡性腫瘤。經病理學確診為胃黏膜高級別上皮內瘤變的術后組織24例為對照組1，男13例，女11例，年齡37～84歲，平均(57.3±12.1)歲；病理學確診為胃黏膜低級別上皮內瘤變的內鏡咬檢組織24例為對照組2，男女各12例，年齡39～79歲，平均(58.3±11.5)歲；距腫瘤邊緣>5 cm的非腫瘤性胃黏膜組織24例為對照組3，男女各12例，年齡38～81歲，平均(57.5±11.5)歲。各組一般臨床特征比較無明顯差別(P>0.05)。

1.2PKM2、ENO1和VEGF檢測方法 4組樣本均常規取材、固定、脫水、包埋并切取4 μm切片。PKM2、ENO1和VEGF的試劑(濃縮液)均購自武漢博士德生物公司。三者的檢測均應用免疫組化SP法，二氨基聯苯胺(DAB)顯色。先進行預實驗，并選擇染色最理想的濃度用于正式實驗。正式實驗均由同一技師操作，嚴格按實驗步驟，做好質控工作。

1.3PKM2、ENO1和VEGF結果的判定 以上皮細胞的細胞質中出現淡黃、棕黃、黃褐色為陽性。著色強度評分：無著色為0分，弱著色為1分，中等程度著色為2分，強著色為3分。選擇上皮細胞分布區且染色較為明顯的區域進行計數，共選擇5個高倍(400倍)顯微鏡下的視野，取平均值，以<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。以二者相乘的得分進行評價，分值范圍是0～9分，以≤4分為陰性，>4分為陽性。

1.4統計學方法 應用SAS6.12統計學軟件行χ2檢驗、t檢驗、線性相關分析。

2 結 果

2.1PKM2、ENO1和VEGF比較 4組PKM2、ENO1和VEGF陽性表達有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 PKM2、ENO1和VEGF陽性表達〔n(%)〕

2.2觀察組中PKM2、ENO1和VEGF在不同臨床病理特征中的表達 PKM2、ENO1和VEGF的表達在不同腫瘤最大徑、增殖指數、淋巴結轉移和TNM分期患者中有統計學差異(P<0.05)，PKM2、ENO1的表達在不同分化程度患者中有統計學差異(P<0.05)。見表2。

表2 觀察組中PKM2、ENO1和VEGF在不同臨床病理特征中的表達〔n(%)〕

2.3觀察組中PKM2、ENO1和VEGF的相關性 PKM2和VEGF(r=0.40，P=0.040)、ENO1和VEGF(r=0.38，P=0.049)呈正相關。其余指標間未見明顯相關(P>0.05)。

3 討 論

胃腺癌臨床表現為侵襲性的生物學行為，轉移率高，浸潤性強，生物學行為不良，預后較差。胃腺癌間質富于血管，可以觀察到腫瘤進展時血管新生。VEGF是重要血管生成促進因子，可以引起血管內皮細胞的分裂和繁殖，可以使高增殖性腫瘤緩解缺氧的狀態，并提供必要的營養〔5,6〕。PKM2是新發現的腫瘤乏氧代謝標志分子，表達升高預示著細胞缺氧的狀態，并為腫瘤乏氧狀態下血管新生提供支持〔7〕。ENO1是F框/WD-40域蛋白(FBXW)7的靶蛋白，可以被FBXW7泛素連接酶在翻譯后進行調控，而FBXW7缺失可以誘導ENO1 蛋白水平明顯增加〔8〕。ENO1可以作為血管內皮細胞的氧化應激蛋白，在細胞質中起催化作用〔9〕。ENO1在生理過程中發揮作用主要是由細胞內定位和內在編碼結構決定的，細胞膜中ENO1促進腫瘤細胞侵襲和轉移，胞質中ENO1可促進腫瘤生長和運動。胞質中ENO1是糖酵解的關鍵酶〔10〕。ENO1在上皮性惡性腫瘤中表達的是癌基因樣作用，即在氧充分的情況下，惡性腫瘤細胞仍有較強的糖酵解過程。而事實上在惡性腫瘤進展中糖酵解作用明顯增強，作為這個途徑的關鍵酶，ENO1存在一個跨胞質的COOH端，通過這個區域活化及穩定纖溶酶原，腫瘤細胞進行入侵和轉移〔11〕。本研究提示PKM2、ENO1和VEGF是促進胃腺癌病變形成的重要因素，PKM2、ENO1誘導腫瘤形成與其對增殖的調控有關，主要與伴侶蛋白結合到PKM2結構域上并進行折疊有關。VEGF的作用可能途徑更多，包括對血管生成，對增殖的調控等。本研究提示PKM2、ENO1和VEGF是促進腫瘤細胞增殖、生長和轉移的重要蛋白質因素。PKM2、ENO1參與腫瘤細胞的生長過程，尤其是PKM2、ENO1高表達后，使腫瘤細胞停滯于幼稚階段，引起腫瘤細胞的失控性增生，細胞相對原始，細胞的形態異型明顯，增殖程度高并具有多向分化的潛能〔12,13〕。本研究提示PKM2、ENO1均可以通過促進VEGF表達起到明顯的促進腫瘤進展的作用，即PKM2、ENO1通過介導VEGF表達發揮促進血管生成的作用。PKM2對腫瘤轉移相關蛋白調節作用明顯，通過誘發上皮-間質轉化促進腫瘤遷移〔14〕。ENO1還可以作用于磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)途徑，也能被弗林蛋白酶激活，參與組織的生理、病理改造過程。PKM2、ENO1和VEGF是淋巴結轉移的促進蛋白，這與腫瘤的高遷移性有關。由于TNM分期是與患者預后相關的重要蛋白，因此PKM2、ENO1和VEGF高表達是腫瘤進展的重要因素，同時檢測PKM2、ENO1和VEGF的表達可能與患者的預后有關〔15〕。腫瘤在生長過程中可以形成間質反應，主要表現是間質的纖維化和炎細胞浸潤，炎細胞浸潤無特殊性，PKM2、ENO1對間質的炎細胞形成起明顯的調節作用，進而與間質反應密切相關〔16,17〕。VEGF可以誘導腫瘤間質中CD34陽性的血管新生，為腫瘤旺熾性生長提供營養支持，同時也為腫瘤細胞播散提供血管通路〔18〕。PKM2在上皮間質轉化中的作用，與上皮間質轉化時Ras相關的C3肉毒底物(Rac)1的活化有關。也有研究認為PKM2可能通過激活基質金屬蛋白酶(MMPs)起作用〔19〕。因此PKM2、ENO1對轉移的調節作用途徑可能更多，尚需要更多實驗研究來證實。