miR-300通過靶向BRD7對肝癌細胞增殖與侵襲的影響

鄧愛民 李建華

(鄭州澍青醫學高等專科學校，河南 鄭州 450064)

目前，針對肝癌最有效的治療方法是手術治療〔1〕，然而85%的患者在診斷時已發生遠處轉移，單純的手術切除甚至肝臟移植都不能獲得很好的治療效果〔2〕。MicroRNA(miRNAs)為單鏈非編碼小分子RNA，通過與靶基因互補結合抑制基因的蛋白翻譯或者降解mRNA使基因的表達水平下調。研究發現，miRNAs通過調節細胞增殖、凋亡、侵襲和轉移等過程參與腫瘤的發生發展〔3〕。同樣，許多miRNAs在肝癌的發生過程中發揮重要作用。比如miR-135a通過作用于FOXO1促進肝癌細胞的遷移和侵襲過程〔4〕。而miR-300在骨肉瘤和胃癌組織中均有較高的表達水平，在骨肉瘤中miR-300通過靶向下調溴含蛋白質(BRD)7參與腫瘤的增殖和侵襲過程，但是關于miR-300在肝癌中發揮作用的研究較少。本文運用肝癌細胞系HepG2和Hep3b，探討miR-300對肝癌細胞增殖和侵襲的影響，并通過過表達實驗判斷miR-300的靶基因BRD7是否參與該過程。

1 材料與方法

1.1細胞與質粒 人肝癌細胞系HepG2、Hep3b和人胚腎上皮細胞293T細胞由中國科學院上海細胞庫提供，其中HepG2和Hep3b生長于RPMI1640培養基中〔含10%滅活胎牛血清(FBS)、青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 μg/ml)、2 mmol/L L-谷氨酰胺〕。293T細胞生長于10% FBS DMEM培養基中。內參質粒為海腎熒光素酶的質粒pRL-TK，購自美國 Promega 公司。pGL3-control報告質粒由本實驗室提供，同時本實驗室將質粒(序列為BRD7 3′UTR)插入pGL3-control蟲熒光素酶序列下游，測序后命名為pGL3-BRD7 3′UTR。miRNAs定量引物(廣州銳博生物科技公司)。上海吉瑪制藥技術有限公司合成miR-300模擬物(mimic)和陰性對照(NC)。

1.2熒光素酶實驗 將293T細胞(規格為2×104個/孔)接種于48孔板，同時加入0.2 ml DMEM培養基孵育。次日，根據LipofectamineTM 2000(Invitrogen，CA，USA)說明書在293T細胞內將miR-300 mimic和NC分別與pGL3-control或pGL3-BRD7 3′UTR及pRL-TK質粒共同轉染。轉染48 h后，收集細胞，應用GLOMAX多功能酶標儀分析熒光素酶。

1.3實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miRNAs的表達 于實驗前1 d在6孔板中鋪入5×104HepG2和Hep3b，次日細胞貼壁，細胞匯合度在60%～70%，依據LipofectamineTM 2000說明書操作，將miR-300 mimic和NC分別轉染入HepG2和Hep3b細胞，轉染48 h后，Trizol試劑提取總RNA，按照SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)說明書建立反轉錄體系，qRT-PCR實驗的操作由ABI7300定量PCR儀完成。所用引物序列見表1。反應溫度： 95℃ 30 s 預變性，95℃ 5 s，60℃ 31 s 循環40次。Ct值按照Applied Biosystem公司 ABI PRISM 7700 Sequence Detection System User Bulletin #2推薦方法獲得，并進行計算，比較目的基因在細胞中的表達水平。采用Real-Time PCR儀器(ABI公司，型號：7900)進行分析，結果根據2-ΔΔCt法進行計算。

1.4Western印跡檢測 在293T細胞中完成miR-300 mimic和NC的轉染過程，轉染48 h后，收集細胞，完成Western印跡實驗。將200 μg/孔加入酶標板中，在電壓恒定為60 V的條件下，電泳0.5 h，當蛋白進入分離膠后，在電壓恒定為110 V的條件下，電泳1.5 h，然后在電流恒定為80 mA的條件下，將蛋白轉膜100 min至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，然后用 5%脫脂牛奶37℃封閉 1 h，Tris鹽酸緩沖液(TBS-T)洗 5 min，洗1 次；加入以抗體稀釋液 1∶1 000配制的鼠抗人BRD7(Santa Cruz,USA)抗體4℃ 過夜，TBS-T洗 10 min共3次； 加入抗體稀釋液 1∶4 000配制的辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG，37℃作用1 h，使用TBS-T清洗3次，每次10 min，采用增強化學發光法(ECL)檢測熒光度。使用抗體稀釋液 1∶1 000配制的抗α-tubulin作為一抗，二抗為抗體稀釋液 1∶4 000 配制的 HRP標記的山羊抗小鼠IgG。

1.5CCK-8增殖實驗 實驗前24 h，在HepG2和Hep3b細胞完成miR-300 mimic和NC的轉染過程，第2天在96孔板中接種胰酶消化細胞(3 000個/孔)，CO2培養箱溫度設置為37℃，濃度為5%，培養5 d內每天每孔中加入10 μl CCK-8，培養1 h，空白孔作為對照，調零，波長設置為450 nm，采用Bioteck DR-3506全自動酶標儀測量OD值。

1.6Matrigel侵襲實驗 RPMI1640 混合液〔2份基質膠(BD Biosciences，USA)和1份RPMI1640 培養基〕置于冰上。24 孔板中加入Transwell 小室(Merck Millipore,Darmstadt,德國)，在每個小室中加入RPMI-1640 混合液，體積為60 μl，將500 μl 10%FBS RPMI1640培養基加入下室，CO2培養箱溫度設置為37℃，濃度為5%，培養5 h。使用RPMI1640培養基配制成細胞懸液(5×105個/ml)消化轉染有miR-300 mimic和NC的細胞。將200 μl 細胞懸液加入小室內，平行做3次。把24孔板放置在細胞培養箱中，培養6 h和12 h后進行小室染色固定，應用CARL ZEISS LSM 510顯微鏡計數，通過統計下室的細胞數量評估細胞侵襲狀態。

1.7統計學方法 應用SPSS17.0軟件行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1過表達miR-300促進肝癌細胞的增殖 將miR-300 mimic和NC分別轉染入HepG2和Hep3b細胞，qRT-PCR首先檢測miR-300的表達水平，與轉染NC比較，轉染miR-300 mimic后，HepG2和Hep3b細胞中miR-300的表達水平均上升〔(4.30±0.61)vs(1.00±0.30)，(5.60±0.30)vs(1.00±0.25)〕，差異具有統計學意義(t=8.521，20.403；P=0.001，0.000)。接著進行CCK-8增殖實驗結果顯示，在實驗第3、4、5天，轉染miR-300 mimic組HepG2細胞的增殖能力與NC組比較差異有統計學意義(P<0.05)；同樣，在實驗第3、4、5天，轉染miR-300 mimic組Hep3b細胞的增殖能力與NC組比較差異有統計學意義(P<0.05)，提示過表達miR-300后細胞的增殖能力明顯高于對照組。見表2。

表2 轉染后不同時間點過表達miR-300促進肝癌細胞的增殖

與NC組比較：1)P<0.05,與第1天比較：2)P<0.05

2.2過表達miR-300促進肝癌細胞的侵襲 Matrigel侵襲實驗結果發現，HepG2細胞在6 h或12 h侵襲到小室底部的細胞數，轉染miR-300 mimic組多于NC組，差異有統計學意義(P<0.05)。同樣，Hep3b細胞在6 h或12 h侵襲到小室底部的細胞數，轉染miR-300 mimic組多于NC組(P<0.05)，提示過表達miR-300明顯促進HepG2和Hep3b細胞的侵襲能力。見表3。

表3 培養不同時間過表達miR-300促進肝癌細胞的侵襲

與6 h比較：1)P<0.05

2.3miR-300靶向作用于BRD7 熒光素酶雙報告實驗結果顯示，miR-300能顯著抑制pGL3-BRD7 3′UTR蟲熒光素酶報告質粒的活性，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表4。進一步通過將miR-300 mimic與NC分別轉染入293T細胞，利用Western印跡實驗檢測BRD7的表達水平，結果顯示，與轉染NC相比，轉染miR-300 mimic后的293T細胞中BRD7的蛋白表達水平明顯下調，見圖1，提示miR-300通過直接靶向BRD7并抑制其表達。

2.4過表達BRD7抑制肝癌細胞的增殖過程 為了說明BRD7是否參與miR-300促進肝癌細胞的增殖過程，將BRD7質粒及對照分別轉染入過表達NC和miR-300 mimic的HepG2和Hep3b細胞中進行CCK-8增殖實驗。在HepG2組中，第3、4、5天，miR-300 mimic+對照質粒組細胞增殖能力與NC+對照質粒組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；而第3、4、5天，NC+對照質粒組細胞增殖能力均高于NC+BRD7組，差異均有統計學意義(P<0.05)；且第3、4、5天，miR-300 mimic+對照質粒組細胞增殖能力與miR-300 mimic+BRD7組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。而Hep3b中CCK-8的結果與HepG2的結果一致。以上結果說明過表達BRD7后能明顯抑制肝癌細胞的增殖能力。見表5。

表4 miR-300靶向作用于BRD7比較

圖1 Western印跡檢測BRD7蛋白表達水平

表5 轉染后不同時間點過表達BRD7抑制肝癌細胞的增殖過程

整體分析為兩因素重復測量方差分析；組間兩兩比較為LSD-t檢驗；1)2)3)分別為與NC+對照質粒組，NC+BRDT組，miR-300 mimic+對照質粒組比較：P<0.05；時間兩兩比較為差值t檢驗；與第1天比較：4)P<0.05

2.5過表達BRD7抑制肝癌細胞的侵襲過程 為了說明BRD7是否參與miR-300促進肝癌細胞的侵襲過程，在轉染入NC和miR-300 mimic的細胞HepG2中分別過表達BRD7質粒及對照質粒，進行Matrigel 侵襲實驗，結果顯示，無論6 h還是 12 h，過表達 BRD7 后HepG2細胞的遷移能力均明顯減弱，差異具有統計學意義(P<0.05)；同樣，無論6 h還是12 h，過表達 BRD7后Hep3b細胞的侵襲能力均明顯減弱，差異具有統計學意義(P<0.05)，提示miR-300通過靶向BRD7促進肝癌細胞的侵襲能力。見表6。

表6 培養不同時間過表達BRD7抑制肝癌細胞的侵襲過程

整體分析為兩因素重復測量方差分析；組間兩兩比較為LSD-t檢驗；1)2)3)分別為與NC+對照質粒組，NC+BRD7組，miR-300 mimic+對照質粒組比較：P<0.05；時間兩兩比較為差值t檢驗；與12 h比較：4)P<0.05

3 討 論

從肝炎病毒感染到肝癌的發生包括一系列過程，如病毒導致持續的肝損傷發展為肝硬化、肝衰竭最后發展為肝癌〔5〕。證據表明，miRNAs在腫瘤發生的早期至晚期過程中都發揮重要作用〔6〕。許多特征性的miRNAs表達譜在肝臟疾病中發生變化。而對這些miRNAs作用的深入研究將為miRNAs作為腫瘤診斷、分期、預后等潛在的非侵入性的生物標記提供理論基礎。本研究發現，過表達miR-300可以促進肝癌細胞的增殖和侵襲過程，且驗證了BRD7為miR-300的靶基因，當過表達BRD7時肝癌細胞的增殖和侵襲過程受到抑制。以上結果得出結論：miR-300通過靶向BRD7促進肝癌細胞的增殖和侵襲過程。

研究表明，miR-300同時具有促癌及抑癌作用〔7,8〕。miR-300在神經膠質瘤中高表達，過表達miR-300可以促進膠質瘤干細胞的自我更新、增殖〔9〕。而在頭頸鱗狀細胞癌中和乳腺癌中miR-300表達水平較低〔10〕，過表達miR-300可以阻止乳腺癌細胞MDA-MB-231中轉化生長因子(TGF)-β誘導的上皮間質轉化。但在本實驗發現miR-300具有促進肝癌細胞增殖與侵襲的作用，驗證了BRD7為miR-300的靶基因，BRD7屬于BRD家族，在心臟、肺、結腸和乳腺等多種組織中普遍表達。免疫熒光實驗發現BRD7定位于細胞核中，可與乙酰化組蛋白H3結合，從而調節染色質重塑。BRD7在結腸癌和鼻咽癌中表達水平較低，過表達BRD7通過細胞周期阻滯抑制鼻咽癌細胞的增殖〔11〕；另外的研究表明，BRD7抑制前列腺癌細胞的增殖；而敲低BRD7可以促進p85α在細胞質聚集，從而穩定p110的表達水平，促進PI3K信號通路的激活〔12〕。本研究發現，miR-300可以靶向下調BRD7的蛋白水平，而過表達BRD7可以抑制肝癌細胞的增殖和侵襲過程，該發現與BRD7為抑瘤基因的結果一致，但miR-300是否通過抑制BRD7的表達間接激活PI3K信號通路發揮該作用仍需進一步研究。