清眩潤目飲對蒸發過強型干眼模型鼠角結膜炎癥因子表達的影響

王佳娣 ，姚 靖 ，曹叢紅 ，于坷鑫

干眼是由于淚液的量或質或流體動力學異常引起的淚膜不穩定和(或)眼表損害，從而導致眼不適癥狀及視功能障礙的一類疾病[1]。臨床將干眼分為五類，以蒸發過強型比例最高，60%以上是由瞼板腺功能障礙（MGD）引起，國內資料亦顯示干眼患者中85%以上與MGD有關[2]，且患病人群呈現出年輕化、低齡化的特點。國際干眼工作組于2007年明確指出炎癥與干眼的發生發展密切相關[3]，眼表組織的免疫性炎癥是干眼最本質的病理生理改變。清眩潤目飲主要在臨床上用于治療瞼板腺功能障礙所致蒸發過強型干眼,并取得良好療效[4-6]，本實驗旨在觀察清眩潤目飲對蒸發過強型干眼模型鼠角、結膜炎癥因子表達的影響，從而探討該藥治療干眼的機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選取18只健康SD大鼠（實驗動物生產許可證號：SCXK（黑）2015-003），雌雄不限，體重 20.0±2.0 g/只，經裂隙燈檢查眼前節無異常，Schirmer試驗＞10 mm/5 min且淚膜破裂時間 （BUT）＞l0 s的動物方可使用。隨機分為3組，分別為空白對照組6只（12眼），模型組6只 （12眼），清眩潤目飲組6只（12眼）。空白對照組不做任何處理，模型組、清眩潤目飲組進行造模。

1.2 主要試劑藥品及實驗儀器

清眩潤目飲（主要藥物組成：玄參、麥冬、生地黃、金銀花、連翹、防風等），中藥按一定比列配伍而成，藥物由黑龍江中醫藥大學附屬一院藥劑科提供，并由我校制劑室加工成濃度為每1 ml含生藥1 g的混懸液，密封，4℃保存備用。75%乙醇、熒光素鈉試紙（許可證號：津食藥監械生產許20100040）、淚液檢測濾紙條 （許可證號：津食藥監械生產許2400041）、鹽酸奧布卡因滴眼液 （參天制藥有限公司，5 ml:20 mg）、電子秤、電子天平、眼科手術顯微鏡（編號：JX7-130213）、白介素 1β（IL-1β）檢測試劑盒（酶聯免疫吸附試驗法）（SEA563Ra，優爾生公司）、白介素6（IL-6）檢測試劑盒（酶聯免疫吸附試驗法）（SEA079Ra，優爾生公司）、腫瘤壞死因子 α（TNF-α）檢測試劑盒 （酶聯免疫吸附試驗法）（SEA133Ra，優爾生公司）眼科顯微手術器械、手持裂隙燈。

1.3 動物模型的制作

33%烏拉坦腹腔注射麻醉，給藥劑量為1 g/kg。麻醉滿意后按如下順序進行評分：①瞼緣形態；②淚膜破裂時間；③角膜熒光素染色；④Schirmer試驗，冷光源下采用改良瞼板腺燒灼法，采用纖維電針改良的燒灼器對鼠雙眼上下瞼緣所有瞼板腺口逐一燒灼，時間約為5 s，術后不使用藥物涂抹鼠結膜囊，共用7 d，形成蒸發過強型干眼模型。

1.4 實驗方法

成功制成干眼模型后，給予清眩潤目飲中藥灌胃治療。實驗劑量按照成人劑量，根據人鼠/兔體表面積等效換算[7]成實驗動物灌胃用藥劑量，qd。模型組用生理鹽水灌胃，qd。連續灌胃4 w。每2 w測量體質量1次，根據體質量調整給藥量。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 蒸發過強型干眼檢查：術后第1、2、4 w檢查瞼緣形態、熒光素染色、Schirmer試驗、淚膜破裂時間。3組動物均由同一個人檢查，每次檢查時間、地點、照明亮度、濕度及溫度確保相同，檢測各組模型鼠瞼緣形態、Schirmer實驗、淚膜破裂時間(BUT)和熒光素染色。裂隙燈下觀察模型鼠瞼緣形態是否規整、有無充血、瞼板腺開口有無堵塞、MarX線有無移位等內容。Schirmer實驗[8]：將濾紙條前端5 mm反折成直角，夾在實驗鼠下瞼外側結膜囊內，5 min后取出濾紙條，2 min后觀察并記錄濾紙條的濕長，濾紙濕潤長度＜10 mm/5 min為異常。淚膜破裂時間[8]：結膜囊滴入熒光素溶液，使鼠被動眨眼數次，一人固定實驗鼠同時雙手撐開眼瞼，一人在手持裂隙燈鈷藍光下用寬裂隙光帶觀察，記錄從最后一次瞬目至角膜出現第一個黑斑即干燥斑的時間，BUT＜10 s為異常。角膜熒光素染色：一人固定實驗鼠，一人將熒光素鈉溶液滴入鼠眼結膜囊內，瞬目后，在裂隙燈鈷藍光下觀察，觀察角膜上皮完整性。

1.5.2 標本采集及病理分析：給藥4 w后3組實驗鼠均以斷頭法處死，取雙眼角膜、結膜組織，小部分以4%多聚甲醛固定,常規石蠟包埋，經過角、結膜間斷連續切片，行HE染色，用光鏡觀察角、結膜組織病理學改變。

1.5.3 角、結膜炎性因子水平及相關蛋白含量測定：按照 TNF-α、IL-1β、IL-6試劑盒說明書步驟，收集各組實驗鼠眼表組織液，室溫下在相應孔中加入相應濃度的標準品和標本，37℃下避光溫育30 min；洗滌5次；在相應孔中加入50μl酶標試劑，密封避光，37℃下溫育30 min；洗滌5次；每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，避光37℃下顯色15min；每孔加入50μl終止液，用酶聯免疫檢測儀在波長450 nm處測量各孔吸光度（OD）值，計算出相應兔眼表中 TNF-α、IL-1β、IL-6濃度含量。 利用Western Blot檢測角、結膜上皮中TLR4、MyD88蛋白質表達。

1.6 統計方法

2 結果

2.1 各組大鼠干眼相關檢測指標的變化

模型組大鼠BUT較空白對照組大鼠明顯縮短，差異有統計學意義（P=0.000）,說明模型復制成功；清眩潤目飲組較模型組BUT延長，差異性顯著（P=0.000），說明清眩潤目飲可有效縮短淚膜破裂時間；清眩潤目飲組較空白對照組（P=0.067），無統計學意義。模型組SIT與空白對照組相比，有顯著性差異（P=0.000），說明模型復制成功；清眩潤目飲組與模型組相比，差異性顯著（P=0.000），說明清眩潤目飲有效果；清眩潤目飲組與空白對照組比較（P=0.075），差異無統計學意義。空白對照組角膜熒光素染色評分與模型組比較差異有統計學意義（P=0.000），說明模型復制成功；清眩潤目飲組與模型組比較，角膜熒光素染色評分降低，差異有統計學意義（P=0.000），說明清眩潤目飲可減少角膜表面損傷；清眩潤目飲組與正常對照組（P=0.076），差異無統計學意義。

2.2 各組大鼠角膜、結膜組織病理學表現

蘇木精-伊紅染色顯示，空白對照組角膜由2～3層鱗狀上皮細胞構成，細胞排列整齊均勻；結膜由2～7層非角化鱗狀上皮細胞組成，細胞形態規則、完整，結膜表面平滑，可見散在分布的杯狀細胞。模型組大鼠角膜、結膜上皮出現缺損，可見炎性細胞浸潤，角膜上皮細胞形態異常，角膜基質層水腫，結膜上皮杯狀細胞明顯減少。清眩潤目飲組大鼠角膜、結膜上皮損傷恢復，細胞層數及細胞形態接近正常，部分組織仍可見上皮表面不連續，杯狀細胞較模型組增多，偶見炎性細胞浸潤(見圖1)。

表1 各組大鼠BUT、Sit及角膜熒光素染色評分的比較

表1 各組大鼠BUT、Sit及角膜熒光素染色評分的比較

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

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2.3 各組大鼠結膜組織炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達量比較

圖1 各組大鼠角膜、結膜組織形態學表現（HE 染色 ×200），空白對照組大鼠角膜、結膜上皮完整，散在分布杯狀細胞；模型對照組大鼠結膜上皮缺損，角膜上皮不光滑；清眩潤目飲組角膜上皮層基本完整，結膜上皮細胞呈增生狀。

IL-1β：模型組大鼠較空白對照組大鼠數值明顯升高，差異有統計學意義（P=0.000）；清眩潤目飲組較模型組IL-1β降低，差異有統計學意義 （P=0.000）；清眩潤目飲組與正常對照組比較，差異無統計學意義（P=0.061）。

IL-6：模型組與空白對照組數值明顯升高，差異有統計學意義（P=0.000）；清眩潤目飲組與模型組比較，IL-6的值降低，差異有統計學意義（P=0.000）；清眩潤目飲組與空白對照組比較（P=0.097），差異無統計學意義。

TNF-α：模型組與空白對照組相比數值明顯升高，差異有統計學意義（P=0.000）；清眩潤目飲組與模型組比較TNF-α的值降低，差異有統計學意義（P=0.000）；清眩潤目飲組與空白對照組（P=0.076），差異無統計學意義。清眩潤目飲可有效降低大鼠結膜組織中細胞因子 IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量，與模型組對比差異具有統計學意義（P=0.000），與正常對照組比較，差異不具統計學意義。

表2 各組大鼠結膜組織炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達量比較

表2 各組大鼠結膜組織炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達量比較

注：**與空白組比較，P＜0.01；##清眩潤目飲組與模型組比較，P＜0.01

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2.4 各組大鼠結膜組織TLR4和MyD88蛋白表達量比較

TLR4蛋白：模型組大鼠較空白對照組大鼠數值明顯升高，差異有統計學意義（P=0.000）；清眩潤目飲組較模型組降低，差異有統計學意義（P=0.000）。

MyD88蛋白：模型組與空白對照組相比數值明顯升高，差異有統計學意義（P=0.000）；清眩潤目飲組與模型組比較，MyD88蛋白降低，差異有統計學意義（P=0.000）。

表3 各組大鼠結膜組織中TLR4和MyD88蛋白表達量的比較

表3 各組大鼠結膜組織中TLR4和MyD88蛋白表達量的比較

注：**與空白組比較，P＜0.01；##清眩潤目飲組與模型組比較，P＜0.01

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圖3 Western blot法檢測各組大鼠結膜組織中炎性因子的表達

3 討論

自擬湯方“清眩潤目飲”以養陰潤肺健脾，清熱祛風除濕為法應用于臨床治療瞼板腺功能障礙致蒸發過強型干眼并取得滿意療效[4-6]。 清眩潤目飲以增液湯為主方加味而成，增液湯是治療多種陰虛津虧之基礎方。方中玄參，甘苦咸而微寒，入肺經，即清熱生津，滋陰潤燥，又瀉火涼血，為君藥。生地黃甘苦而寒，清熱養陰，壯水生津，以增玄參滋陰潤燥之力；麥冬甘寒、微苦，入肺經，具清熱養陰潤肺生津之功，滋養肺胃陰津，使水液生化有源，與生地黃共為臣藥。白鮮皮，苦寒，入脾經，具有清熱燥濕、祛火解毒、祛風止癢之功。金銀花甘寒，連翹味苦，二藥合用共奏疏散風熱、清熱解毒之效，且連翹又可消腫散結，增加君臣藥的清熱作用。防風辛甘而溫，入脾經，祛風止癢之效強，又具升清燥濕止痛之功，四藥合用可有效改善瞼眩赤爛、刺癢等癥狀，共為佐藥。甘草，入脾經，補脾益氣，防寒涼之藥太過傷及脾胃，入肺經而潤肺可增君、臣藥之功，清熱解毒之功又可助佐藥緩解瞼弦赤爛癥狀，調和諸藥而為使藥。上藥合用既能養陰生津潤肺健脾，又能清熱解毒祛風除濕，是治療瞼眩赤爛所致白澀癥的有效方劑。

隨著抗炎治療的廣泛應用，通過現代研究發現，很多中藥均具有良好的抗炎作用，且毒副作用小。現代研究表明增液湯具有增加水液分泌，調節免疫炎癥的功效。孫麗英等[9]發現增液湯能降低干燥綜合征 （SS）模型小鼠血清中TNF-α和IL-1β的表達水平，減少炎性細胞因子產生。從現代藥理學研究養陰清熱方清眩潤目飲的藥物組成及功效表明：玄參具有抗炎、免疫調節等功效,其有效成份可通過激活核因子 -κB（NF-κB）通路抑制 IL-1β 及 TNF-α 的表達[10]，降低炎性因子的濃度。生地黃中的地黃多糖能促進樹突狀細胞的成熟，下調由于IL-12和TNF-α生成誘導的泡飲和吞噬作用，增強宿主免疫[11]，生地黃還具有皮質激素樣免疫抑制作用[12]。麥冬中提取到的多種類型化合物(如皂苷、黃酮、呋喃等)都可從不同途徑抑制炎癥發展[13]。白鮮皮提取物具有良好的抑菌活性，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有較好的抑制作用[14]。金銀花[15]對急性炎癥的作用與地塞米松、皮炎平的藥理作用相當，可調節機體免疫力，對感染性疾病具有治療作用。連翹具有免疫調節及抗炎作用[16]：其抗炎機制可能與抑制TNF-α和IL-6這兩種炎癥因子的生成和多成分作用有關。防風有解熱、鎮痛、抗炎、抗過敏、調節免疫等藥理作用[17]。甘草酸苷與多種細胞表面不同的受體如Toll樣受體2（TLR2）、TLR4結合，活化下游信號，如P38MAPK、pJNK 和 NF-κB，上調 TNF-α、IL-1β、IL-6的水平，引起炎癥反應[18-19]。

既往研究證實炎性細胞因子IL-1，IL-6，TNF-α和β的水平在蒸發過強型干眼患者淚液和結膜上皮中較正常人顯著升高，且與干眼的嚴重程度相關，這些因子可作為臨床診斷或療效監測的重要參考指標[20]。TLR4是最早發現且研究最多、最清楚的TLR相關蛋白，通過其下游的髓樣分化因子88（MyD88）依賴性及非依賴性信號轉導通路兩個路徑，NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號轉導通路，誘導炎性介質（IL-1α、IL-6、TNF-α、MMPS 等）釋放。 目前已證實MAPK信號轉導通路與NF-κB信號轉導通路直接參與干眼免疫反應的啟動[21]。干燥環境、淚液高滲等外界環境刺激可影響TLR4的活性，激活MAPK與NF-κB信號轉導通路并影響細胞的增殖、分化、凋亡以及炎性介質的釋放。結合本次實驗結果表明：清眩潤目飲可顯著降低蒸發過強型干眼模型動物淚液中IL-1β、IL-6及TNF-α的含量，這說明本方具有良好的抗免疫性炎癥作用。蒸發過強型模型鼠的角、結膜組織中發現TLR4、MyD88因子亦呈升高趨勢，服用中藥清眩潤目飲后，給藥組TLR4、MyD88因子表達較模型組顯著降低，具有統計學意義 （P=0.000）。實驗病理學觀察亦顯示，用藥28 d后，模型組實驗鼠球結膜炎癥程度最重，清眩潤目飲組大鼠角膜、結膜上皮損傷恢復，細胞層數及細胞形態接近正常，部分組織仍可見上皮表面不連續，杯狀細胞較模型組增多，偶見炎性細胞浸潤。因此，我們認為清眩潤目飲及其有效成分在蒸發過強型干眼的治療中發揮作用，基于免疫的非感染性炎癥與干眼的密切關系，推測清眩潤目飲對蒸發過強型干眼的免疫調節作用主要通過干預TLR4及其信號轉導通路，減少炎性細胞因子釋放，減緩杯狀細胞凋亡而發揮其藥理用。