支鏈siRNA多靶點對乳腺癌4T1細胞凋亡作用的影響

周 悅 莫 黎 王 辛 周慶偉 (南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 20029)

乳腺癌是女性發病率最高的惡性腫瘤，也是導致腫瘤相關死亡的主要原因之一〔1〕。近年來，我國乳腺癌發病率逐年攀升。上海、北京、天津及沿海地區為高發區，流行趨勢明顯改變為城市高于農村，沿海地區高于內地，乳腺癌嚴重影響了患者的生活及生存質量。因此，對乳腺癌發病機制及開發新藥研究尤為重要〔2〕。隨著對乳腺癌研究的深入，研究者們對傳統的治療，如手術、化療、放療及分子靶向治療療效重新審視，目前尚無有效的治療手段。因此尋找新的乳腺癌治療策略尤為必要。近年來，以小干擾RNA(siRNA)為基礎的干擾(RNAi)技術發展迅速，其以低毒、特異和高效等優勢越來越廣泛受到研究者的關注并取得了顯著進展〔3〕。為此，本實驗設計了支鏈siRNA多靶點抑制劑作用于乳腺癌4T1細胞，分析并探討其對乳腺癌細胞增殖及凋亡作用的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑 乳腺癌4T1細胞(購自中國科學院上海細胞生物學研究所)，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司提供;MTT由美國Sigma生產;Lipofectamine2000試劑OPTI-MEM(1X)均由美國生產;標準胎牛血清由天津灝洋生物制品科技有限責任公司生產。

1.2 序列合成 RNA oligo合成由上海GenePharma公司提供。

1.3 主要儀器 倒置光學顯微鏡(日本NiKon ECLIPSE 80i);二氧化碳培養箱(日本三洋電機株式會社制造);酶標儀(中國北京普朗新有限公司);熒光顯微鏡及流式細胞儀(日本Olympus Tokyo)。

1.4 實驗分組 分為正常對照組﹑陰性對照組(0.003 μg/μl)、siRNA-STAT3 組 (0.066 μg/μl) ﹑siRNA-STAT6 組 (0.066 μg/μl) ﹑ siRNA-STAT5a(0.066 μg/μl)組及 siRNA-STAT5b(0.066 μg/μl)組;Mixture組(0.26 μg/μl)由4種基因序列混合液配制;各實驗組均按GenePharma公司說明書配置操作。Lipofectamine2000轉染試劑按說明書完成。每實驗組乳腺癌4T1細胞轉染6 h后，棄掉培養液，各組均按實驗要求檢測各種指標。

1.5 MTT法檢測乳腺癌4T1細胞增殖活性 取對數生長期細胞，調整細胞懸液為2×104/ml，接種至96孔板，每孔 100 μl，每組設 4個復孔，置入 37℃，5%CO2培養箱中孵育，待細胞貼壁后，各組分別在24 h、48 h及72 h檢測細胞增殖活性，并在每個時間點，每孔加入MTT溶液20 μl，置入培養箱中孵育4 h后，棄掉培養液，每孔加入150 μl DSMO，振蕩器震蕩10 min。采用酶標儀在490 nm下檢測各實驗組吸光值計算細胞存活率。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取對數生長期細胞，0.25%胰酶消化，1 500 r/min，離心 5 min，棄上清，調整細胞密度為1×106/ml，接種至6孔板，每實驗孔分別加入1 ml細胞懸液及1 ml 10%細胞培養液，細胞貼壁后，置入37℃的5%CO2培養箱，孵育培養48 h;棄培養液，收集各組細胞，各實驗組分別加入195 μl Annexin V-FITC 結合液，5 μl Annexin V-FITC 及 80 μl碘化吡啶，輕輕搖晃，室溫避光，孵育 20 min，待上機檢測。

1.7 統計學方法 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗。

2 結果

2.1 支鏈siRNA多靶點對乳腺癌4T1細胞增殖活性的影響 在24 h，Mixture組與正常對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05);Mixture組與其余各組比較差異無統計學意義(均P＞0.05);在48 h，Mixture組分別與正常對照組及陰性對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01);與 siRNA-STAT6組、siRNA-STAT5a及 siRNA-STAT5b組比較差異有統計學意義(P＜0.05);siRNA-STAT3組與正常對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05);在72 h，Mixture組與正常對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，與其余各組比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

2.2 支鏈siRNA多靶點對乳腺癌4T1細胞凋亡率的影響 在48 h，各實驗組細胞凋亡率均明顯低于Mixtrue組，差異有統計學意義(P＜0.05)，表明支鏈siRNA多靶點具有明顯誘導乳腺癌4T1細胞凋亡的作用，見表1。

表1 支鏈RNA多靶點對乳腺癌4T1細胞增殖活性及凋亡率的影響()

表1 支鏈RNA多靶點對乳腺癌4T1細胞增殖活性及凋亡率的影響()

與正常對照組比較:1)P＜0.05;與陰性對照組比較:2)P＜0.01，與Mixture組比較:3)P＜0.05

組別 增殖活性(OD，n=4)24 h 48 h 72 h凋亡率(%，n=3)正常對照組 0.28±0.01 0.57±0.05 0.71±0.06 5．17±1．223)陰性對照組 0.26±0.04 0.57±0.03 0.70±0.02 6．70±0．323)siRNA-STAT3 組 0.24±0.06 0.46±0.021) 0.63±0.07 15．80±1．783)siRNA-STAT6 組 0.24±0.04 0.56±0.093) 0.63±0.05 8．59±2．203)siRNA-STAT5a 組 0.27±0.03 0.47±0.093) 0.62±0.09 11．89±1．373)siRNA-STAT5b 組 0.26±0.02 0.49±0.074) 0.64±0.04 11．98±1．933)Mixtrue 組 0.22±0.011)0.37±0.041)2)0.54±0.061)28．86±2．54

3 討論

信號轉導與轉錄激活因子(STATs)家族在腫瘤細胞增殖、凋亡及侵襲轉移等方面發揮了及其重要作用。其中STAT3在惡性腫瘤中的研究最為廣泛，并且參與了多種腫瘤的信號通路和胞內信號傳導通路如乳腺癌、肺癌及肝癌等。研究顯示，STATS蛋白家族可以被白細胞介素、生長因子類及某些惡性腫瘤蛋白等多種胞內因子受體激活的一組蛋白，共包括7個家族成員:如 STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b 及STAT6〔4，5〕。其中，STAT1、STAT5 和 STAT6 的異常表達可導致惡性腫瘤的發生、發展，而STAT3作為惡性腫瘤治療的位點，因為STAT3激活后可產生免疫抑制效應，抑制了STAT3的過度表達不僅阻滯惡性腫瘤細胞過度增殖，同時還增強體內對腫瘤的免疫能力〔6〕。有研究報道，STAT5a在信號通路中的作用及對基因表達的調控研究較為廣泛，STAT5a在乳腺組織正常發育過程中具有突出作用〔7，8〕，STAT5a 與 STAT5b 與乳腺癌病理生理學密切相關。STAT5a與STAT5b是最常見的轉錄因子組合，在調節乳腺癌上皮惡性腫瘤方面具有雙重作用〔9〕。STAT5a的激活在調節乳腺細胞生長與分化方面和乳腺癌發生、發展中發揮重要作用〔10〕。研究表明，STAT6不僅在免疫系統的調節中發揮重要作用，而且與腫瘤細胞增殖、凋亡及腫瘤的發生相關〔11～15〕。

迄今為止，傳統的腫瘤治療方法如放、化療及免疫治療等存在著諸多局限性，RNAi作為新型的基因沉默技術，具有高特異性抑制靶基因的表達、療效顯著、副作用輕微等優點〔16，17〕，研究表明，信號轉導通路的異常表達在腫瘤進程中起著重要作用〔18〕。惡性細胞無限增殖、侵襲及轉移是腫瘤的主要特征，也是腫瘤惡性程度的重要標志。腫瘤的侵襲、轉移是一個復雜的過程，涉及多個基因的異常表達，也受多種細胞因子調控〔19〕。細胞凋亡與增殖是腫瘤發生和發展的重要指標，這些變化的調控作為預兆的信息。因此，細胞凋亡和分裂指數關系到腫瘤患者的生存率〔20〕。本研究證實支鏈siRNA能夠明顯抑制乳腺癌4T1細胞增殖及促進誘導細胞凋亡。