胃泌素及其受體拮抗劑對人胃癌細胞株MKN45中骨橋蛋白表達的影響

蘇 薇 吳會超 (遵義醫學院附屬醫院消化內科，貴州 遵義 563003)

胃癌發病率、死亡率呈逐年上升趨勢。胃泌素是胃腸道細胞分泌的胃腸激素，研究證實胃泌素在胃癌發生發展過程中扮演重要角色〔1〕。目前關于胃泌素的作用機制尚未闡明，基因調控、家族途徑等為其主要作用途徑，可抑制腫瘤細胞凋亡，刺激癌細胞增殖分化。骨橋蛋白(OPN)為磷酸化糖蛋白，其與致癌潛能相關，可能參與腫瘤轉移過程，如促進細胞的浸潤、黏附、抑制凋亡及促進血管的形成等〔2，3〕。本文分析胃泌素及其受體拮抗劑對人胃癌細胞株MKN-45中OPN表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人胃癌細胞MKN45由上海慧穎生物科技有限公司提供;丙谷胺購自江蘇亞邦愛普森藥業有限公司;噻唑藍(MTT)購自上海信裕生物技術有限公司;胰蛋白酶購自上海雅心生物技術有限公司;胃泌素與OPN試劑盒購自上海廣銳生物科技有限公司;RPMI1640培養基購自上海信帆生物科技有限公司;新生小牛血清購自北京諾亞杰生物科技有限公司;放射免疫檢測儀購自瑞萊生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 細胞培養溫度＜37℃，在 RP-MI1640培養基中加入10%小牛血清，進行人胃癌細胞MKN45的培養，3 d傳代1次，利于細胞貼壁良好生長。取細胞貼壁后72 h細胞，通過0.25%胰蛋白酶處理，制成5×107個/L的細胞懸液。

1.2.2 人胃癌細胞MKN45增殖檢測 MKN45胃癌細胞經0.125%胰蛋白酶處理，在RPMI1640培養基稀釋后，制成5×107個/L的細胞懸液。接種環境溫度＜37℃，接種于96孔板，培養箱條件為:5%二氧化碳、37℃恒溫培養。實驗分為 3組，胃泌素組:胃泌素10－6mol/L;聯合組:胃泌素(10－6mol/L)+丙谷胺(10－2mol/L);對照組:培養液中不添加丙谷胺。培養完成后，MTT法檢測人胃癌細胞MKN45增殖情況。用二甲基亞砜(DMSO)溶解甲臜后在490 nm波長處測定其吸光度值，可間接反映活細胞數量。每孔加MTT溶液〔5 mg/ml用磷酸鹽緩沖液(PBS)配〕20 μl繼續孵育4 h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液。每孔加150 μl DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分融解。于酶標儀上測定光密度值(OD值)，持續3次。促細胞增殖率(PR)=(OD實驗組值－OD對照組值)/OD實驗組值×100%，PR值為正，表明藥物對細胞增殖具有促進作用;PR值為負，表明藥物對細胞增殖具有抑制作用;PR為0，表明對細胞增殖無明顯影響。

1.2.3 OPN蛋白檢測 于24孔板上，加入細胞數量為5×107個/L的細胞懸液，細胞貼壁后分組并加藥。12、24、36 h加入抑肽酶，每孔1 500 U，收集培養上清液，采用1∶10細胞裂解液裂解胃癌細胞，與培養上清液3 000 r/min離心15 min，獲得上清液，保存在－80℃下待測，最后嚴格按照放射免試劑盒操作要求，收集上清液中OPN含量，通過免疫組織化學法檢測胃癌細胞株MKN45中OPN蛋白的表達及胃泌素和丙谷胺對其表達的影響。其次，通過實時熒光定量PCR法(RTPCR)檢測胃癌細胞株MKN45中OPN蛋白的表達及胃泌素和丙谷胺對其表達的影響，首先提取細胞總RNA，測定RNA的濃度;其次，進行逆轉錄反應，再次，進行瓊脂糖電泳以檢測擴增產物的均一性。將配好的3%瓊脂糖電泳液灌注制膠板凝固后，上樣。低壓電泳儀100 V，55 mA約60 min跑膠。紫外分析儀上觀察結果。采用BIO-RAD軟件計算出目的基因與內參的比值，OPN mRNA表達量以OPN與內參的比值表示。

1.3 統計學分析 應用SPSS22.0軟件進行χ2檢驗、t檢驗。

2 結果

2.1 各組人胃癌細胞MKN45增殖情況 胃泌素組人胃癌細胞MKN45增殖OD值明顯高于對照組、聯合組，隨著培養時間的延長，OD值明顯升高。聯合組中丙谷胺對人胃癌細胞MKN45增殖具有抑制作用，隨著培養時間的延長，抑制作用明顯增加。見表1，圖1。

表1 各組人胃癌細胞MKN45增殖情況()

表1 各組人胃癌細胞MKN45增殖情況()

與胃泌素組比較:1)P＜0.05

組別 24 h 48 h OD值 PR(%)OD值 PR(%)聯合組 0.54±0.051) － 0.77±0.061) －胃泌素組 0.61±0.04 +11.48 0.96±0.05 +19.79對照組 0.56±0.021) －8.93 0.79±0.081) －21.52

圖1 各組胃癌細胞增殖情況(SP，×400)

2.2 各組OPN表達情況 OPN出現在人胃癌細胞MKN45培養液中，培養時間越長，OPN表達明顯增高，胃泌素組OPN水平明顯高于對照組和聯合組，聯合組明顯低于對照組(P＜0.05)。見表2，圖2。

表2 各組OPN水平比較()

表2 各組OPN水平比較()

與對照組比較:1)P＜0.05;與胃泌素組比較:2)P＜0.05

組別 12 h 24 h 36 h聯合組 0.67±0.231)2) 0.78±0.241)2) 0.91±0.121)2)胃泌素組 0.97±0.181) 1.25±0.171) 1.67±0.261)對照組 0.71±0.12 0.98±0.11 1.19±0.20

圖2 OPN、β-actin PCR的擴增產物瓊脂糖凝膠電泳

3 討論

胃癌是消化內科常見惡性腫瘤，其發病率、死亡率相對較高。胃癌發生原因復雜，與飲食、環境、基因、細菌感染等因素有關，早期癥狀不明顯，就診時已發展到中晚期。流行病學調查顯示，胃癌患者治療后復發率、遠處轉移率較高，累及周圍臟器，導致多臟器衰竭，增加死亡風險〔4～6〕。在胃癌發生發展轉移過程中，細胞因子、信號通路等參與其中。隨著臨床對胃癌發病機制研究不斷深入，發現人胃癌細胞MKN45增殖、OPN、胃泌素在胃癌發生、發展、轉移過程中占據重要地位。多數研究表明，胃泌素的促癌作用臨床已證實〔7～9〕。胃泌素由胃腸道細胞分泌，其作用機制為刺激癌細胞增殖。胃泌素主要通過基因、家族等途徑作用，但具體作用機制尚不明確。有研究表明，胃泌素 10－6～10－9mol/L時，具有促進MKN45細胞增殖的作用，與丙谷胺聯合時，該促進作用被阻斷，提示胃泌素經受體介導刺激體外培養胃癌增殖〔10，11〕。早期有文獻報道，胃泌素可促進十二指腸旁黏膜表皮生長因子(EGF)分泌，表明胃泌素通過EGF刺激胃黏膜增殖〔12〕。

OPN是一種磷酸化糖蛋白，具有非膠原性和分泌性〔13〕。OPN在不同動物各種組織中均有表達，正常情況下OPN幾乎不表達或表達甚微，但在一些誘導因素下大量表達，可促進腫瘤惡化，可作為腫瘤轉移的標志物。有研究表明，檢測胃癌組織中OPN表達，其表達率高達100%，72%以上胃癌組織或淋巴轉移灶中OPN呈高表達狀態，提示OPN蛋白和胃癌發生發展有關。OPN主要參與惡性腫瘤細胞侵襲轉移作用，可能機制為〔14〕:(1)通過受體整合素 α、β5發揮作用;(2)與肝細胞生長因子發揮協同作用;(3)與表面CD44結合發揮作用;(4)與血管內皮生長因子發揮協同作用;(5)通過自分泌及旁分泌發揮途徑;(6)抑制NO、O2、OH－等產生促進轉移細胞生存。有研究表明〔15〕，OPN蛋白在乳腺癌組織中呈高表達，推測參與了乳腺癌鈣化過程。有研究表明，胃泌素可促進OPN表達，并促進人胃癌細胞MKN45增殖〔16〕。

本研究結果提示胃泌素可促進胃癌細胞MKN45增殖和OPN表達，且丙谷胺起到了拮抗作用。胃癌細胞MKN45產生過程中，分泌出胃泌素，采用丙谷胺可抑制胃泌素的分泌，一旦分泌胃泌素，胃泌素受體又在細胞表面表達，可見丙谷胺可抑制胃泌素的分泌。有文獻報道〔17〕，17肽胃泌素在1～1 000 nmol/L時可促進MKN45細胞增殖，聯合丙谷胺時，阻斷了這種促進作用。丙谷胺是臨床治療消化性潰瘍的常見藥物，具有抗胃泌素的作用，有利于控制胃酸，抑制胃蛋白酶分泌，促進胃黏膜愈合。胃泌素作用于癌細胞的途徑廣泛，如神經內分泌系統、自分泌等，促進腫瘤細胞增殖，故及時阻斷胃泌素對腫瘤細胞的刺激十分重要。在胃癌治療過程中，丙谷胺治療效果雖無法與放療、化療比擬，但其可抑制癌細胞生長、增殖、分化，為胃癌治療指明新的方向〔18〕。

綜上，胃癌細胞MKN45中存在OPN表達，胃泌素可促進胃癌細胞MKN45增殖、OPN表達，聯合胃泌素受體拮抗劑后，可抑制腫瘤細胞增殖和OPN表達。