中樞nesfatin-1表達下調對大鼠胰島素敏感性的影響

肖 蓉 令狐昌敏 唐 亮 熊 娜 郭耘菘 賈彥軍 周澤華(重慶市涪陵中心醫院內分泌科，重慶 408000)

nesfatin-1是一種新發現的下丘腦攝食抑制因子，由核組蛋白(NUCB)2N端水解產生〔1〕。研究表明，nesfatin-1不僅僅作為攝食調控因子在能量代謝方面起到作用，并且在胰島素抵抗及糖尿病的發生、發展中發揮著重要的作用〔2～4〕。然而，中樞性 nesfatin-1調節胰島素敏感性及糖代謝的具體作用及分子機制尚不完全清楚。本研究擬利用已成功構建的針對nesfatin-1的RNAi干擾腺病毒Ad-shNUCB2下調nesfatin-1基因表達，行第三腦室微量輸注，建立下丘腦 nesfatin-1低表達模型。通過3-3H葡萄糖和2-脫氧-3H葡萄糖(3H-2DG)為示蹤劑的擴展高胰島素正葡萄糖鉗夾技術評價中樞nesfatin-1下調對大鼠糖、脂代謝及胰島素敏感性的影響，旨在進一步探索中樞nesfatin-1在胰島素抵抗和糖尿病發生發展中所發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人工腦脊液購自BioPanda公司，每升里面包含氯化鈉6.279 g，氯化鉀0.216 g，氯化鈣0.353 g，氯化鎂 0.488 g，碳酸氫鈉 1.932 g，葡萄糖0.6 g，磷酸氫二鈉0.358 g，pH7.3～7.4;大鼠源性 nesfatin-1腺病毒高效率干擾重組載體(Ad-shNUCB2)由本研究組前期構建，并且本研究組前期已經證明Ad-shNUCB2具有非常高的抑制率，其有效序列:5'-GATCCCCGGTGGAAAGTGCAAGGATATTCAAGAGATA TCCTTGCACTTTCCACCTTTTTGGAAA-3';重組綠色熒光蛋白腺病毒載體(Ad-shGFP)作為空載對照病毒，由重慶醫科大學檢驗醫學院臨床檢驗診斷學重點實驗室提供。

1.2 實驗動物 健康雄性4周齡SD大鼠60只，體重100～120 g，均購自第三軍醫大學大坪醫院的野戰外科研究所實驗動物中心。適應性喂養1 w后，根據隨機表法完全隨機分為6組，分別為普食+人工腦脊液組(NCA組，n=10);普食+Ad-shGFP組(NCG組，n=10);普食喂養+Ad-shNUCB2組(NCN組，n=10);高脂喂養+人工腦脊液組(HFA組，n=10);高脂喂養+Ad-shGFP組(HFG組，n=10);高脂喂養+AdshNUCB2組(HFN組，n=10)。喂養10 w，普通飼料(熱卡百分比:脂肪7.39%，蛋白質18.81%，碳水化合物51.96%，其他21.94%)，高脂飼料(熱卡百分比:脂肪26.98%，蛋白質14.83%，碳水化合物40.97%，其他17.5%)。兩種飼料均由第三軍醫大學大坪醫院的野戰外科研究所實驗動物中心提供。

1.3 大鼠腦室內微量給藥系統的建立 大鼠腦室內微量給藥系統的建立操作方法均同本課題組前期研究〔5〕。大鼠禁食5 h后，測量其體質量并氯安酮腹腔麻醉(87 mg/kg)備皮后，將其俯臥位頭部固定于大鼠腦立體定位儀，常規皮膚消毒，沿顱頂中線皮膚切開，暴顱骨及前囟，參照腦立體定位圖譜定位第三腦室〔5〕，利用螺絲釘及玻璃離子水門汀固定套管并縫合皮膚。術后單籠喂養，并預防性使用青霉素。第三腦室置管術后第5天，套管內輸注血管緊張素Ⅱ10 ng(10 ng稀釋到10 μl生理鹽水中)，監測大鼠飲水量，15 min飲水＜5 ml者予以剔除。

1.4 擴展高胰島素-正葡萄糖鉗夾技術 鉗夾術前2 d，空白對照組(NCA和HFA組)每只大鼠第三腦室內輸注人工腦脊液10 μl，陰性對照組(NCG和 HFG組)輸注 Ad-shGFP(109PFU/只)，干預組(NCN和HFN組)輸注大鼠nesfaitn-1干擾重組腺病毒載體AdshNUCB2(109PFU/只)。擴展鉗夾術操作同前〔6〕:鉗夾開始前1 h(0 min)由動脈導管給予3-〔3H〕標記葡萄糖6 μCi，隨后以0.2 μCi/min的速度輸注直至鉗夾結束。t=120 min 時開始鉗夾，以 6 mU·kg－1·min－1的速度輸注胰島素及25%葡萄糖溶液，根據血糖調整葡萄糖輸注率(GIR)，使血糖維持在 4.5～5.5 mmol/L。于鉗夾 0、60、140、160、170、180 min分別取血液樣品分離血漿，置于－80℃用于測定代謝指標。1.5 攝食測定 在普食喂養及高脂喂養的大鼠第三腦室分別注入人工腦脊液(10 μl/只)、Ad-shGFP(109PFU/只)、Ad-shNUCB2(109PFU/只)后，每隔24 h連續7 d檢測大鼠攝食量及體重變化。

1.6 組織葡萄糖攝取率測定 在鉗夾術的基礎上，通過課題組已經建立的方法采用3H-2DG(Amersham公司)作為示蹤劑測定各組織葡萄糖攝取率(GU)〔5〕。鉗夾結束前45 min，由靜脈導管注入3H-2DG 30 μCi，并于注入3H-2DG 后的 2、5、10、15、20、30 min 和45 min 7個時間點留取血液標本，并記錄各點血糖濃度。實驗結束后，立即處死大鼠，快速剝離附睪脂肪、棕色脂肪、比目魚肌和腓腸肌組織，置于生理鹽水洗滌3次，濾紙吸盡水分，立即置于液氮;檢測前于液氮中快速取出組織，稱取約100 mg組織，置于0.2 mmol/L NaOH中孵育裂解，0.4 mol/L HCl中和后，加入閃爍杯，室溫過夜，LS6500液閃儀檢測每分鐘衰變率。

1.7 各項參數計算 根據Steel公式〔7〕計算葡萄糖利用率:即在鉗夾穩態時，外源性葡萄糖的輸注率(GIR)反映了整個機體對胰島素的敏感性。機體對葡萄糖利用率等于葡萄糖清除率(GRd)，GRd=〔3H〕標記GIR(dpm/min)/血漿〔3H〕標記葡萄糖比活性(dpm/mg);肝糖生成(HGP)=GRd-GIR;基礎狀態下HGP=GRd。

1.8 血漿生化指標測定 血糖測定采用葡萄糖氧化酶法;血漿胰島素采用放射免疫法測定(美國Linco公司);血漿三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)均用酶法測定;血漿3-〔3H〕葡萄糖比活性、3H-2DG血漿及組織比活性均采用液體閃爍計數法測定(美國Amersham公司產品)。

1.9 腦組織nesfatin-1 mRNA水平測定 在普食喂養及高脂喂養的大鼠第三腦室分別注入人工腦脊液(10 μl/只)、Ad-shGFP(109PFU/只)、Ad-shNUCB2(109PFU/只)，7 d后，留取各組大鼠中樞組織，利用Trizol提取組織總RNA，逆轉錄為 cDNA，采用SYBR GreenⅡ熒光染料(Takara公司，日本)通過實時熒光定量PCR法檢測腦組織nesfatin-1 mRNA表達水平。結果以 Ct值表示，以 β-actin基因作為內參，用 2－△△Ct計算腦組織目的基因nesfatin-1 mRNA相對表達水平。其中引物序列如下:nesfatin-1:上游引物:5'-TTTGAACACCTGAACCACCA-3';下游引物:5'-TGCAAACTTG GCTTCTTCCT-3';β-actin上游引物:5'-CCCTGAACCCTAAGGCCAACCGTGAAAA-3';下游引物:5'-TCTCCG GAGTCCATCACAATGCCTGTG-3'。

1.10 免疫組化檢測腦組織nesfatin-1蛋白水平 4%多聚甲醛固定、石蠟包埋的大鼠腦組織進行切片、脫蠟，3%過氧化氫孵育 15 min，5%胎牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉25 min，兔抗大鼠nesfatin-1單克隆抗體(Abcam，英國)4℃孵育過夜，利用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕緩洗滌3次，進行辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗室溫孵育1 h，之后按照說明說進行二氨基聯苯胺(DAB)顯色。

1.11 統計學方法 采用SPSS19.0軟件包進行t檢驗及單因素方差分析。

2 結果

2.1 各組大鼠基礎生化指標及攝食比較 大鼠禁食12 h后，NCA組、NCG組和 NCN組大鼠空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FIns)、FFA、TG、TC、LDL-C 及HDL-C無顯著差異，同樣，以上所測指標在HFA組、HFG組和HFN組間也無顯著差異(均P＞0.05)。而與NCA組相比，HFA組、HFG組及HFN組FIns、FFA、TG、TC及LDL-C顯著增加(均P＜0.05)，HDL-C顯著降低(均P＜0.05)。FBG在各組間均無顯著性差異(表1)。與NCA組相比，中樞輸注Ad-shNUCB2能夠顯著抑制大鼠腦組織nesfatin-1的mRNA及蛋白表達(圖1，表2);此外，在普食喂養下或者高脂喂養下，中樞輸注Ad-shNUCB2能夠顯著增加大鼠攝食，于第3天達至高峰;然而，體重變化無統計學差異(表2)。

圖1 各組腦組織不同區域nesfatin-1蛋白表達(DAB，×100)

表1 各組大鼠基礎生化指標比較(，n=10)

表1 各組大鼠基礎生化指標比較(，n=10)

與NCA組比較:1)P＜0.01，下表同

組別 FBG(mmol/L) FIns(mU/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L) HDL-C(mmol/L) LDL-C(mmol/L) FFA(mmol/L)NCA 組 5.56±0.16 21.71±0.52 0.38±0.01 1.44±0.03 0.93±0.02 0.60±0.17 0.73±0.02 NCG 組 5.36±0.19 22.21±0.98 0.38±0.03 1.61±0.08 0.89±0.04 0.62±0.03 0.69±0.03 NCN 組 5.21±0.16 22.20±1.83 0.38±0.03 1.63±0.08 0.92±0.05 0.59±0.03 0.70±0.05 HFA 組 5.66±0.15 25.80±1.011) 0.95±0.051) 2.03±0.111) 0.72±0.051) 0.87±0.061) 1.82±0.121)HFG 組 5.40±0.17 25.55±0.751) 1.01±0.121) 2.01±0.101) 0.73±0.061) 0.83±0.071) 1.59±0.181)HFN 組 5.42±0.12 26.95±1.831) 1.00±0.091) 1.92±0.101) 0.77±0.051) 0.95±0.061) 1.68±0.111)

表2 各組中樞輸注Ad-shNUCB2后nesfatin-1 mRNA、體重和攝食比較(，n=10)

表2 各組中樞輸注Ad-shNUCB2后nesfatin-1 mRNA、體重和攝食比較(，n=10)

組別 nesfatin-1 mRNA 體重(g) D1(g/d) D3(g/d) D5(g/d) D7(g/d)NCA 組 1．000±0．093 26．57±2．19 67．41±7．29 80．97±4．68 78．17±4．32 75．30±4．49 NCG 組 0．097±0．080 26．10±0．83 69．8±6．84 69．33±2．39 70．21±2．51 69．57±3．51 NCN 組 0．660±0．0701) 27．23±3．00 70．00±4．94 69．10±5．10 69．86±3．71 69．10±2．37 HFA 組 0．630±0．0821) 38．00±2．371) 80．08±3．971) 83．54±4．751) 82．29±5．121) 81．50±3．541)HFG 組 0．640±0．0791) 36．73±2．071) 80．55±3．011) 80．95±4．621) 84．80±6．201) 81．03±2．041)HFN 組 0．390±0．6201) 38．73±1．361) 84．84±5．711) 93．37±3．921) 88．11±2．381) 87．56±1．971)

2.2 正葡萄糖高胰島素鉗夾術中各生化指標的變化

鉗夾穩態期，各組FBG均維持在4.5～5.5 mmol/L。外源性給予同樣的胰島素輸注率，血漿FIns升高到基礎值的4～6倍。與NCA組相比，HFA組、HFG組和HFN組血漿FIns水平顯著增高(P＜0.01)，而NCA、NCG和NCN組之間，HFA組、HFG組及HFN組之間血漿FIns水平沒有顯著差異(P＞0.05)。鉗夾穩態中，各組 TG、TC、FFA、LDL-C水平均受到明顯抑制(P＜0.01)。但HFA組、HFG組及HFN組上述指標仍顯著高于NCA組(均P＜0.01)，而NCA和NCN組之間，HFA組、HFG組及HFN組之間血脂水平沒有顯著差異(均 P＞0.05)，見表 3。

表3 高胰島素鉗夾術穩態期各組大鼠生化指標比較(，n=10)

表3 高胰島素鉗夾術穩態期各組大鼠生化指標比較(，n=10)

組別 FBG(mmol/L) FIns(mU/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L) HDL-C(mmol/L) LDL-C(mmol/L) FFA(mmol/L)NCA 組 5.27±0.94 99.03±0.64 0.16±0.01 1.16±0.12 0.95±0.01 0.56±0.01 0.21±0.01 NCG 組 5.15±0.14 95.51±5.97 0.20±0.02 1.24±0.04 0.95±0.05 0.54±0.03 0.21±0.01 NCN 組 5.30±0.20 97.39±2.92 0.20±0.02 1.21±0.04 0.97±0.04 0.52±0.03 0.25±0.02 HFA 組 5.17±0.10 122.12±6.971) 0.68±0.061) 1.60±0.101) 0.76±0.021) 0.83±0.061) 0.69±0.081)HFG 組 5.04±0.11 123.55±13.831) 0.73±0.111) 1.61±0.111) 0.76±0.031) 0.70±0.051) 0.68±0.091)HFN 組 5.08±0.10 123.64±6.381) 0.68±0.061) 1.57±0.091) 0.82±0.041) 0.75±0.041) 0.68±0.041)

2.3 穩態時糖代謝各指標比較 鉗夾穩態時，與NCA組相比，HFA組 GIR及 GRd明顯下降(P＜0.05)，與NCA、NCG組分別相比，NCN 組GIR、GRd明顯下降(均P＜0.05);同樣與HFA、HFG組分別相比，HFN組 GIR、GRd顯著下降(均 P＜0.05)。AdshNUCB2中樞干預顯著增加大鼠肝糖生成(HGP)，與NCA、NCG組分別相比，NCN組HGP明顯升高(均P＜0.05);同樣，與HFA、HFG組分別相比，HFN組 HGP增高(均P＜0.05)。在鉗夾穩態時，與NCA或NCG組相比，NCN組HGP抑制率明顯降低;與HFA、HFG組分別相比，HFN組HGP抑制率也明顯下降(均P＜0.05)，見表 4。

表4 鉗夾穩態時各組胰島素敏感性指標比較(，n=10)

表4 鉗夾穩態時各組胰島素敏感性指標比較(，n=10)

與 NCA 組比較:1)P＜0．01;與 NCG 組比較:2)P＜0．01;與 HFG 組比較:3)P＜0．01;與 HFG 組比較:4)P＜0．01;與 NCN 組比較:5)P＜0．01; 下表同

組別 葡萄糖輸注率(mg·kg－1·min－1)葡萄糖清除率(mmol·kg－1·min－1) 肝糖生成量(mg·kg－1·min－1) 肝糖生成抑制率(%)NCA 組 23．53±1．95 0．175 6±0．003 2 8．08±2．84 0．41±0．09 NCG 組 22．09±1．23 0．177 2±0．005 4 9．80±1．35 0．37±0．07 NCN 組 17．18±0．961)2) 0．163 5±0．002 31)2) 12．25±1．231)2) 0．25±0．021)2)HFA 組 10．04±1．761) 0．139 0±0．002 81) 14．52±2．101) 0．28±0．051)HFG 組 10．16±1．782) 0．138 0±0．002 52) 14．69±0．932) 0．28±0．062)HFN 組 5．96±0．633)4)5) 0．127 0±0．002 23)4)5) 16．94±1．213)4)5) 0．20±0．043)4)5)

2.4 各組織葡萄糖攝取率比較 經10 w高脂喂養后，HFA組附睪脂肪、棕色脂肪、比目魚肌和腓腸肌的GU均顯著低于NCA組(均P＜0.05)。而中樞nesfatin-1表達下調能顯著降低大鼠肌肉及脂肪組織GU，與NCA、NCG組分別相比，NCN組附睪脂肪組織、棕色脂肪組織、比目魚肌和腓腸肌GU均顯著降低(均P＜0.05);同樣，與HFA、HFG組分別相比，HFA組各組織中GU均明顯降低(均P＜0.05)。見表5。

表5 各組葡萄糖攝取率比較(，n=10，%)

表5 各組葡萄糖攝取率比較(，n=10，%)

組別 腓腸肌 比目魚肌 棕色脂肪 白色脂肪NCA 1．34±0．38 3．43±0．69 7．32±0．91 0．40±0．06 NCG 1．18±0．41 3．52±0．70 7．35±1．05 0．39±0．06 NCN 0．77±0．151)2) 1．98±0．361)2) 5．21±0．461)2) 0．30±0．031)2)HFA 0．47±0．11) 1．39±0．261) 3．43±0．501) 0．19±0．031)HFG 0．48±0．112) 1．33±0．212) 3．45±0．382) 0．19±0．022)HFN 0．34±0．033)4)5)0．87±0．123)4)5)2．40±0．373)4)5)0．14±0．033)4)5)

3 討論

nesfatin-1是新發現由NUCB2 N端水解產生的82個氨基酸所組成的肽段，分子量為9.7×103。NUCB2由一組高度保守的蛋白質組成，包括24個氨基酸組成的氨基末端信號肽和396個氨基酸序列〔1〕。nesfatin-1廣泛分布于下丘腦、胰島β細胞、脂肪組織等〔8〕。下丘腦作為生命活動的中樞。下丘腦的一系列核團，例如室旁核、弓狀核、腹內側核、視上核等形成復雜和相互影響的網絡，分泌相關細胞因子和蛋白調節營養攝入及能量代謝〔9，10〕。然而，作為中樞作用因子，中樞nesfatin-1調節機體胰島素敏感性及葡萄糖代謝的具體機制尚不完全清楚。本研究首次證實中樞nesfatin-1表達抑制能夠明顯抑制外周組織對機體葡萄糖的攝取與利用，促進肝糖產生，加重機體胰島素抵抗程度。

研究顯示，大鼠第三腦室、第四腦室內輸注nesfatin-1可抑制大鼠夜間攝食行為，而長期輸注nesfatin-1可導致大鼠體質量下降，尤其是脂肪組織明顯減少〔1，3，11，12〕。與正常人群相比，2 型糖尿病患者及糖調節受損者空腹血漿nesfatin-1水平顯著降低，表明nesfatin-1可能與胰島素敏感性及糖代謝有關〔13〕。本課題組前期通過向高脂大鼠第三腦室內短期輸注nesfatin-1重組蛋白，研究發現大鼠肝臟糖異生明顯被抑制，同時肝臟胰島素敏感性顯著提高〔4〕，此外中樞nesfatin-1表達下調能夠明顯促進肝糖異生調控基因表達，抑制機體胰島素作用信號通路〔14〕，然而，對于中樞nesfatin-1表達下調對機體肝糖產生及系統胰島素敏感性的影響尚未有報道。

本研究提示高脂喂養大鼠出現肥胖、胰島素抵抗和脂代謝紊亂，擴展胰島素鉗夾術中發現，在相同的外源胰島素輸注下，為維持穩定的血糖水平，機體外源性葡萄糖的需要量明顯減少，即機體胰島素的敏感性降低;且胰島素對肝糖的抑制作用顯著降低，說明肝胰島素敏感性同樣降低，中樞nesfatin-1低表達顯著降低機體外周組織葡萄糖攝取率。這些結果充分說明，中樞nesfatin-1表達下調能同時降低肝和外周組織胰島素敏感性。然而，長期的中樞nesfatin-1信號改變對機體胰島素敏感性的影響尚需進一步研究。研究發現大鼠腦室內長期輸注nesfatin-1，能夠在減少夜間攝食行為的同時降低大鼠體質量，并導致機體脂肪含量減少〔1〕，本研究結果與文獻報道一致，向SD大鼠腦室內輸注Ad-shNUCB2后，中樞nesfatin-1表達下調能夠增加攝食，然而，大鼠體重沒有明顯變化，這可能與本研究干預時間較短相關。FFA、TG、TC、LDL-C及HDL-C與對照組相比無顯著差異，提示短期下丘腦nesfatin-1表達下調對脂代謝影響不大。然而，nesfatin-1是否對脂代謝產生影響仍需進一步研究。