Gli通過PI3K/AKT途徑促進食管腺癌OE33細胞上皮-間質轉化

杜媛鯤 米 源 廖海江 王 雷 (河北醫科大學期刊社，河北 石家莊 05007)

食管癌分為食管鱗癌和食管腺癌兩種病理類型，近年來，我國雖然以食管鱗癌為主，但隨著人們生活水平的提高，食管腺癌的發病率呈上升趨勢〔1〕，全世界新增食管腺癌病例中有18%來自中國〔2〕。早期食管腺癌無明顯癥狀，當確診時多數已發生侵襲轉移，即使采取以手術為基礎的放化療綜合治療，五年生存率并沒有顯著提高。因此，應進一步了解食管腺癌的生物學行為，為食管腺癌的治療提供新的依據。Hedgehog(Hh)信號通路是近年來腫瘤領域研究熱點之一，與肝癌〔3〕，胰腺癌〔3〕、肺腺癌〔4〕、前列腺癌〔5〕等多種腫瘤的發生、發展和轉移關系密切，其中Gli作為Hh通路下游的核心組分在信號傳導中發揮核心調控作用，但其在食管腺癌中發揮的分子調控機制尚未完全闡明。

脂磷酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號傳導通路與腫瘤的侵襲、轉移相關〔6〕，并且近年來研究發現在多種腫瘤中Hh信號通路可通過與PI3K/AKT信號通路交叉調控促進腫瘤進展〔7～9〕，但在食管腺癌組織中Hh信號通路是否通過PI3K/AKT信號通路發揮作用及如何影響該信號通路尚缺乏有效證據。本實驗通過研究人食管腺癌細胞系OE33中Gli表達和PI3K/AKT通路的相互關系，初步探討腫瘤的轉移機制，為食管腺癌的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 人食管腺癌細胞系OE33購自英國Sigma-Aldrich公司，GANT61購自美國Selleckchem公司，N-Shh蛋白購自美國EBioscience公司，RPMI1640培養液購自美國Corning公司，胰酶胎牛血清購自美國Gemini公司，Mini-PROTEAN TGX預制膠Taqman基因表達預混液購自美國應用生物系統公司，Gli1引物及探針、Gli2引物及探針、β-catenin引物及探針、NCadherin引物及探針、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物及探針購自美國生命技術公司，蛋白酶抑制劑購自德國羅氏公司，M-PER培養細胞總蛋白提取試劑、Pierce-BCA蛋白分析試劑盒購自美國賽默飛公司，Tris/甘氨酸/電泳緩沖液購自美國伯樂公司，電化學發光(ECL)試劑購自美國Thermo-Pierce公司，β-catenin鼠抗人單克隆抗體Gli1兔抗人多克隆抗體購自美國abcam公司、AKT兔抗人單克隆抗體和p-AKT兔抗人單克隆抗體(Ser473)購自美國cell signaling公司，Gli2鼠抗人單克隆抗體、N-Cadherin兔抗人單克隆抗體和GAPDH鼠抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，總RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司，cDNA合成試劑盒。

1.1.2 主要儀器 NanoDrop 8000全光譜紫外-可見光分光光度計(美國Thermo Scientific公司)，ELX800多功能酶標儀(美國Bio-Tek公司)，ABI 7900HT高通量熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀(美國應用生物系統公司公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 OE33細胞均培養于10%胎牛血清、青-鏈霉素各100 mg/ml的RPMI1640培養液培養基中，于恒定濕度95%、恒定溫度37℃、5%CO2培養箱中孵育。

1.2.2 實時熒光定量PCR法 將培養瓶中對數生長期生長狀態良好的細胞經0.25%胰酶消化，離心和細胞計數后以每孔0.1×106鋪于12孔板，待第2天細胞培養至70%～80%融合時，更換無血清培養基并加入GANT61(15 μmol/L)，同時設 N-Shh 組(0.5 mg/ml)、GANT61＆N-Shh 組 (15 μmol/L GANT61 處理細胞30 min后0.5 mg/ml N-Shh處理細胞24 h)和二甲基亞砜(DMSO)組(對照組)，以上方法處理細胞24 h后按照總RNA提取試劑盒說明書方法提取RNA，將樣本經NanoDrop 8000全光譜紫外-可見光分光光度計檢測總RNA濃度，按cDNA反轉錄試劑盒說明書進行cDNA反轉錄，然后用無R-Nase水稀釋10倍后于每孔加 cDNA 4.5 μl、Gli1、Gli2、β-catenin、N-Cadherin 和GAPDH各自的引物及探針0.5 μl及Taqman基因表達預混液 5 μl，反應體系共計 10 μl/孔，加樣在 384 孔板上，于 PCR 儀中在 95℃、10 s，60℃、10 s，72℃、10 s的反應條件下進行PCR檢測，共40個循環。采用2－ΔΔCt法計算各組mRNA相對表達水平。實驗重復3次。

1.2.3 Western印跡 同樣方法設GANT61組，N-Shh組、GANT61＆N-Shh組和DMSO組。24 h后常規收集每組樣本的總蛋白提取液，BCA法測定樣本的總蛋白濃度。在Mini-PROTEAN TGX預制膠中以10 μg每道蛋白上樣，在200 V、40 min的反應條件下經聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)進行電泳。冰水浴聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉膜。TBST洗膜，5% 脫脂奶粉/TBST液封膜1 h，加入一抗，一抗工作液濃度:Gli1(1∶1 000)，Gli2(1 ∶250)，β-catenin(1 ∶10 000)，N-Cadherin(1 ∶250)、p-AKT(1 ∶1 000)，AKT(1 ∶1 000)，GAPDH(1 ∶20 000)，4℃孵育過夜。第2天更換二抗，二抗工作濃度均為1∶20 000，室溫孵育1 h。ECL試劑顯色后于暗室X線曝光顯影。實驗重復3次。

1.2.4 Transwell侵襲實驗 將matrigel從－80℃冰箱中取出置于4℃待其融化，按照1∶4比例用培養基稀釋后放置于培養箱待固化。實驗分為4組:GANT61組、N-Shh組、DMSO組、GANT61＆N-Shh組。收集處理后的OE33細胞吹打為單細胞懸液重懸在無血清培養液中，上室加入包含7.5×104個細胞的細胞懸液100 μl，下室加入含10%血清的培養液500 μl，注意防止大氣泡的產生，于細胞培養箱中培養24 h。24 h后經固定、染色后在400倍顯微鏡下隨機選取4個視野，觀察穿膜細胞數。本實驗重復3次。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析，組間比較采用LSD法。

2 結果

2.1 實時熒光定量PCR結果 Gli1、Gli2、β-catenin、N-cadherin mRNA表達各組間差異均有統計學意義(F=211.273，P=0.000;F=688.096，P=0.000;F=369.842，P=0.000;F=872.859，P=0.000)。其中GANT61作用于 OE33細胞24 h后導致 Gli1(P=0.000)、Gli2(P=0.000)、β-catenin(P=0.000)和 N-cadherin(P=0.000)mRNA的表達水平顯著低于DMSO組，差異有統計學意義;與DMSO組相比，N-Shh組可以顯著上調腫瘤細胞Gli1(P=0.000)、Gli2(P=0.000)、β-catenin(P=0.000)和 N-Cadherin(P=0.000)的 mRNA表達水平，差異有統計學意義;與DMSO組相比，GANT61＆N-Shh組可以部分下調腫瘤細胞 Gli1(P=0.001)、Gli2(P=0.000)、β-catenin(P=0.000)和N-cadherin(P=0.000)的mRNA表達水平，差異有統計學意義。GANT61＆N-Shh組與GANT61組相比，Gli1(P=0.000)、Gli2(P=0.000)、β-catenin(P=0.002)和 N-Cadherin(P=0.000)的mRNA表達水平增高，差異有統計學意義。見圖1。

圖1 實時熒光定量PCR檢測各基因表達水平

2.2 Western 印跡結果 Gli1、Gli2、p-AKT、β-catenin、N-cadherin蛋白表達各組間差異有統計學意義(F=492.076，P=0.000;F=2 607.524，P=0.000;F=2 414.111，P=0.000;F=7 669.963，P=0.000;F=2 565.358，P=0.000);AKT蛋白表達各組間沒有統計學差異(F=2.190，P=0.167)。GANT61處理OE33細胞 24 h，后 Gli1(P=0.000)、Gli2(P=0.000)、p-AKT(P=0.000)、β-catenin(P=0.167)和 N-cadherin(P=0.000)蛋白表達均顯著低于DMSO組，差異有統計學意義;與DMSO組相比，N-Shh處理組Gli1(P=0.000)、Gli2(P=0.000)、p-AKT(P=0.000)、β-catenin(P=0.000)和N-cadherin(P=0.000)蛋白表達均顯著增高，差異有統計學意義;GANT61＆N-Shh組與DMSO對照組相比可以部分下調Gli1(P=0.000)、Gli2(P=0.000)、p-AKT(P=0.000)、β-catenin(P=0.000)和 N-cadherin(P=0.000)蛋白表達，差異有統計學意義。GANT61＆N-Shh組與GANT61組相比，Gli1(P=0.000)、Gli2(P=0.000)、p-AKT(P=0.000)、β-catenin(P=0.000)和 N-Cadherin(P=0.000)蛋白表達均高于GANT61組，差異有統計學意義，見圖2。

2.3 Transwell侵襲實驗 各組間比較差異有統計學意義(F=1 040.927，P=0.000):與DMSO組穿膜細胞數(154±3.06)比較，GANT61組穿膜細胞數(84±1.53)明顯減少(P=0.000)，N-Shh組穿膜細胞數(173±2.00)較 DMSO組明顯增多(P=0.000)，GANT61＆N-Shh組穿膜細胞數(106±4.16)較 DMSO組減少(P=0.000)，GANT61＆N-Shh組穿膜細胞數較GANT61組增多，差異有統計學意義，見圖3。

圖2 Western印跡方法檢測OE33中Gli1、Gli2、p-AKT、AKT、β-catenin和N-cadherin蛋白表達

圖3 Transwell侵襲實驗檢測各組OE33細胞侵襲能力

3 討論

Hh信號通路在胚胎發育、器官成熟的過程中起著非常重要的作用，但當胚胎成熟后此通路將被抑制〔10〕。Hh信號通路的異常激活已證實與許多惡性腫瘤(如胃癌)的發生、侵襲、轉移相關〔11，12〕。經典的 Hh通路是過度表達的Shh結合跨膜受體Ptch，解除了Ptch對Smo的抑制作用，使其將信號傳遞給核轉錄因子Gli，活化Gli1和Gli2。Gli1是Hh通路重要的轉錄因子，促進Hh通路下游靶基因的轉錄表達，其通路的過度激活可引起細胞過度增殖和促進腫瘤細胞侵襲轉移。由于Gli在Hh信號通路中發揮著承上啟下的核心作用，因此針對Gli為靶點的治療可以對Hh通路進行精確的調控〔13，14〕。PI3K 在細胞增殖/凋亡等許多細胞進程中起著非常重要的作用〔15～17〕。EMT是腫瘤浸潤和轉移的重要機制之一，通過EMT過程，上皮細胞失去細胞極性并且細胞之間失去黏附功能，增加了間皮細胞的特性，導致細胞更容易侵襲轉移〔18〕。N-cadherin是間質細胞的重要標記之一，在上皮細胞來源的腫瘤中出現N-cadherin高表達是EMT的重要特征，與腫瘤侵襲轉移密切相關，可作為判斷預后的生物學指標〔19，20〕。β-catenin也被認為是 EMT 過程重要的標記物之一，而且有研究表明肺癌組織中Gli1和βcatenin高表達呈正相關，應用重組Shh蛋白激活Hh通路可以促進腫瘤的侵襲與轉移〔21，22〕。Yoo 等〔23〕已發現在胃癌中Shh可以通過激活PI3K/AKT通路促進EMT過程，進而促進腫瘤的侵襲轉移。因此，本實驗選取Gli1和Gli2的特異性抑制劑GANT61和Shh/Gli通路激活劑N-Shh對食管腺癌細胞進行研究，初步探討Gli過度表達是否通過活化PI3K通路進而影響食管癌細胞EMT進程并最終導致腫瘤細胞侵襲轉移的機制。

本實驗結果顯示GANT61可以明顯下調OE33細胞的Gli1、Gli2基因表達以及EMT重要標記物N-cadherin和β-catenin的基因表達。從蛋白水平檢測發現GANT61可以明顯下調 Gli1、Gli2 、p-AKT、N-cadherin、β-catenin蛋白表達，AKT蛋白表達沒有顯著變化。侵襲實驗也更進一步證實抑制Gli的表達可以下調食管腺癌細胞的侵襲能力，分析其原因可能是GANT61通過降低PI3K/AKT的磷酸化水平下調EMT進程，而NShh可以明顯上調腫瘤細胞的Gli1、Gli2、N-cadherin、β-catenin基因和蛋白表達以及p-AKT蛋白表達，但對AKT蛋白表達沒有影響，表明N-Shh可以通過活化Shh/Gli通路上調p-AKT和EMT指標的表達。為了更好理解Shh/Gli通路和p-AKT之間的關系，我們采取了救援實驗，既先應用GANT61抑制Gli的表達后再應用N-Shh激活Shh/Gli通路觀察相應蛋白的表達，結果顯示 Gli1、Gli2 、p-AKT、N-cadherin、β-catenin 等蛋白表達得到部分恢復，說明Shh/Gli通路和PI3K/AKT通路之間是相互關聯的，可能是PI3K/AKT信號通路在Shh信號通路調控食管腺癌細胞的EMT過程中可能發揮著重要作用，Gli通過活化PI3K/AKT通路進而上調N-cadherin、β-catenin蛋白表達，促進EMT進程。

綜上所述，食管腺癌的EMT過程受多通路、多因子相互調控的作用。本研究初步探討了Gli在食管腺癌轉移中的作用機制，發現在食管腺癌中異常活化的Shh/Gli通路可通過調控PI3K/AKT通路促進EMT過程，進而促進腫瘤的侵襲轉移。