肝細胞癌中SETDB1的表達及其對腫瘤生長的影響

（西南醫科大學附屬醫院 肝膽外科，四川 瀘州 646099）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是我國最常見的消化系統惡性腫瘤之一[1-2]。編碼基因位于人類染色體1q21上的SET結構域分支型1（SET domain bifurcated 1, SETDB1）是一種組蛋白賴氨酸N端甲基轉移酶[3-5]。有研究顯示，前列腺癌及非小細胞肺癌中高表達的SETDB1對腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲具有促進作用，并且能對患者預后進行評價[6-7]。本研究檢測HCC中SETDB1的表達，通過敲除SETDB1研究其對肝癌細胞體內外增殖凋亡能力的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 臨床資料 選取2014年1月-2016年3月于西南醫科大學附屬醫院肝膽外科行手術切除的50例HCC患者的組織標本及35例因肝外傷或肝血管瘤而切除患者的正常肝組織標本。所有標本于離體30 min內取材，于中性甲醛溶液中保存、固定。

1.1.2 細胞來源及主要試劑 肝癌MHCC97H細胞購自上海細胞庫，并由本科實驗室保存。SETDB1特異性shRNA慢病毒顆粒（病毒載體類型：psi-LVRH1GP）購自廣州復能基因公司，DMEM（11965-084）、胎牛血清（16000044）購自美國Gibco公司，Annexin V凋亡檢測試劑盒（FITC/PI雙染法,E606336）購自上海生工生物工程有限公司，Trizol試 劑（15596026）、RT-PCR試劑盒（SuperScript?One-Step RT-PCR System with Platinum? Taq DNA Polymerase, 10928042） 及qPCR試劑盒（DyNAmo Flash SYBR Green qPCR Kit, F415L）購自美國Invitrogen公司，兔抗人SETDB1單克隆抗體（#2196）、兔抗人組蛋白H3單克隆抗體（#9717）、兔抗人H3K9me3單克隆抗體（#13969）、兔抗人p53單克隆抗體（#2527）及兔抗人β-actin單克隆抗體（#4970）購自美國CST公司；兔SP免疫組織化學試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司。

1.2 免疫組織化學染色

將石蠟包埋的標本組織切片常規進行脫蠟及水化預處理；用抗體稀釋液按1∶100比例稀釋兔抗人SETDB1多克隆抗體，滴加抗體于組織切片上并充分浸沒組織標本。4℃恒溫冰箱內孵育過夜，洗凈未結合一抗后，使用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗結合相應一抗，DAB法顯示陽性蛋白。每張組織切片在400倍視野下隨機選取10個視野進行閱片。＞10%癌細胞胞核呈棕黃色或棕褐色染色即為陽性，否則判定為陰性。

1.3 細胞培養及慢病毒感染

MHCC97H細胞于適宜環境中培養，穩定傳2代或3代后進行實驗。將MHCC97H細胞按過夜增殖至愈合度達70%的密度接種于6孔細胞培養板。達到預定培養密度后移除培養基，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline, PBS）充分洗滌細胞。慢病毒感染分組：每孔加入1 ml sh-SETDB1慢病毒上清液、2 ml完全培養基及15μg Ploybrene作為sh-SETDB1組；每孔加入1 ml sh-Control慢病毒上清液、2 ml完全培養基及15μg Ploybrene作為sh-Control組。轉染48 h后，使用含2μg/ml Puromycin的完全培養液篩選穩定轉染細胞株。

1.4 qRT-PCR

通過Trizol試劑提取標本及細胞RNA，配制逆轉錄及PCR擴增體系。逆轉錄條件：50℃預變性30 min，94℃變性2 min，循環1次后94℃變性15 s，60℃退火30 s，68℃延伸3 min，循環40次后72℃繼續延伸10 min。通過2-△△Ct法計算SETDB1基因的相對含量。

1.5 Western blot檢測

采用RIPA試劑提取細胞總蛋白，凝膠垂直電泳分離蛋白，70 V恒壓轉膜150 min，5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）室溫封閉1 h；用3%濃度的脫脂奶粉溶液按1∶1 000比例稀釋SETDB1、H3K9me3、p53及β-actin抗體。在4℃下孵育相應條帶過夜。洗去殘余一抗后采用1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標記山羊抗兔或抗鼠二抗室溫孵育條帶1 h。于暗室內，增強化學發光法觀察蛋白表達。每個樣本獨立重復實驗3次。

1.6 平板克隆形成試驗

將MHCC97H細胞按500個/孔均勻接種于6孔板中，更換完全培養基2次/周。培養2周后，使用4%多聚甲醛固定細胞30 min，1%結晶紫染色15 min，置于蒸餾水中洗去多余染液。風干后將6孔板置于網格紙上統計每孔克隆形成數量，計算克隆形成率。每個樣本獨立重復實驗3次。

1.7 流式細胞術

將MHCC97-H細胞用預冷PBS工作液沖洗2次，胰酶消化細胞后1 500 r/min離心5 min沉淀細胞，預制緩沖液調整細胞數為1×106個/ml，將500μl細胞懸液與5μl Annexin V-FITC及10μl PI混合，室溫遮光反應10 min后上機測試。

1.8 裸鼠皮下移植瘤模型的復制

6只5周齡BLAB/c裸鼠，隨機分為sh-SETDB1組和sh-Control組，每組3只，分組后各組適應性飼養1周。分別取對數生長期的sh-SETDB1和sh-Control細胞，以冷PBS溶液制成細胞懸液，調整細胞終濃度為2.0×107個/ml。使用1 ml注射器，將0.2 ml細胞懸液（約含4.0×106個細胞）接種于裸鼠背部近右下肢處皮下組織內，復制裸鼠皮下移植瘤模型。裸鼠飼養4周，每周測量腫瘤長度及寬度，按（長軸×短軸2）/2來計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。

1.9 統計學方法

數據分析采用SPSS 13.0統計學軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或單因素方差分析，計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SETDB1蛋白在HCC和正常肝組織中的陽性表達

免疫組織化學染色發現，SETDB1位于細胞核。50例HCC組織中SETDB1蛋白的陽性表達率為80.00%（40/50），35例正常肝組織中SETDB1蛋白的陽性表達率為31.43%（11/35），經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=20.238，P=0.000）。見圖1。

圖1 SETDB1在HCC和正常肝組織中的表達

2.2 不同影響因素下的SETDB1陽性表達

HCC組織中不同直徑腫瘤比較，差異有統計學意義（P＜0.05），SETDB1陽性表達與腫瘤體積增大關系密切。見表1。

表1 不同影響因素下的SETDB1陽性表達率比較

2.3 沉默SETDB1表達對MHCC97H細胞增殖、凋亡的影響

sh-Control組SETDB1 mRNA相對表達量為（1.00±0.00），sh-SETDB1組 為（0.38±0.11）， 經t檢驗，差異有統計學意義（t=5.219，P=0.017）。sh-Control組SETDB1蛋白相對表達量為（0.46±0.08），sh-SETDB1組為（0.17±0.02），經t檢驗，差異有統計學意義（t=3.071，P=0.036）。sh-SETDB1組抑制MHCC97H細胞克隆率為（81.34±10.29）%，sh-Control組為（53.22±8.31）%，經t檢驗，差異有統計 學 意 義（t=4.025，P=0.029）。sh-SETDB1組 促進MHCC97H細胞凋亡率為（31.45±6.19）%，sh-Control組為（18.08±5.33）%，經t檢驗，差異有統計學意義（t=3.740，P=0.031）。見圖 2。

圖2 沉默SETDB1表達對MHCC97H細胞增殖、凋亡的影響

2.4 沉默SETDB1表達對裸鼠皮下移植瘤生長的影響

sh-SETDB1組MHCC97H細胞在裸鼠體內的生長速度為（0.010±0.004）cm3/d，sh-Control組為（0.050±0.010）cm3/d，經t檢驗，差異有統計學意義（t=23.605，P=0.039）。飼養4周后處死動物獲取皮下腫瘤，sh-SETDB1組最終腫瘤體積為（1.34±0.31）cm3，sh-Control組為（0.41±0.12）cm3，經t檢驗，差異有統計學意義（t=3.581，P=0.031）。見圖3。

2.5 沉默SETDB1表達對MHCC97H細胞中H3K9me3和p53表達的影響

sh-Control組MHCC97H細胞中H3K9me3的表達水平為（0.73±0.09），sh-SETDB1組為（0.13±0.02），經t檢驗，差異有統計學意義（t=4.427，P=0.025）sh-Control組 p53的表達水平為（0.67±0.06），sh-SETDB1組 為（0.21±0.04）， 經t檢 驗， 差異有統計學意義（t=3.060，P=0.041），sh-Control組H3的表達水平為（0.42±0.03），sh-SETDB1組為（0.39±0.02），兩組比較，差異無統計學意義（t=1.036，P=0.205）。SETDB1并未調控組蛋白H3的表達，而是通過調控組蛋白H3甲基化抑制p53的表達,促進腫瘤細胞增殖。見圖4。

圖3 沉默SETDB1表達對MHCC97H細胞移植瘤生長的影響

圖4 沉默SETDB1表達對MHCC97H細胞內H3K9me3和p53表達的影響

3 討論

SETDB1作為一種蛋白甲基化轉移酶，實驗證據表明其能與異染色質蛋白1及其共抑制子KAP1在異染色質中結合而促進H3K9me3形成[8-9]。本研究的免疫組織化學染色結果顯示，50例HCC組織中SETDB1的陽性表達率要高于35例正常肝組織，并且高表達SETDB1的患者腫瘤體積增大。說明在臨床上檢測肝癌組織中SETDB1的表達對判斷患者腫瘤進展有一定參考價值。

目前，雖然在許多腫瘤中都發現了SETDB1的異常表達，但是其具體的生物學功能尚不完全清楚[10]。在非小細胞肺癌中，SETDB1通過正向激活WNT-βcatenin信號通路來促進HCC細胞增殖，相似的生物學作用也存在于腦膠質母細胞瘤中[11-12]。但是WU等[13]的研究結果卻指出，SETDB1能與SMAD2和SMAD3形成SETDB1/SMAD2/3抑制性復合體來抑制TGF-β誘導的肺癌細胞轉移。在本研究中，筆者通過細胞增殖及凋亡實驗表明，體外沉默SETDB1的表達致使肝癌MHCC97H細胞的增殖能力受到抑制。除此之外，動物腫瘤生長模型也指明，下調SETDB1的表達能夠抑制MHCC97H細胞在體內的生長。綜合上述結果表明，下調SETDB1的表達是抑制肝癌生長的有效手段之一。SETDB1能夠特異性甲基化組蛋白H3的K9位點，形成甲基化的組蛋白H3K9me3。有研究指出，H3K9me3的形成與包括p53在內的許多抑制腫瘤細胞生長的基因失活有關[14]。在本研究中，筆者在沉默SETDB1表達后發現H3K9me3的表達水平降低，而p53的表達水平升高，提示SETDB1促腫瘤生長可能與抑制p53的表達有關。另外，p53在肺癌中還可能作為一種轉錄抑制因子結合在SETDB1的啟動子區域，抑制其轉錄過程[15]。說明p53與SETDB1存在復雜的相互制約關系。在HCC中p53的失活是一種普遍現象，這也部分揭示了SETDB1在HCC中高表達的原因[16]。

綜上所述，SETDB1是HCC中高表達的促癌分子，沉默SETDB1的表達可能通過恢復p53的表達而抑制HCC增殖并促進其凋亡。