不同濃度重組人促紅細胞生成素對高氧暴露下人肺泡Ⅱ型上皮細胞功能的影響研究

黨嘉文，董文斌，雷小平，何娜，郭琳

本研究價值：

高氧肺損傷尚無有效的治療辦法，本實驗從細胞水平分析重組人促紅細胞生成素（rhEPO）對高氧暴露下人肺泡Ⅱ型上皮細胞（A549細胞）的形態(tài)、增殖、凋亡的影響，明確了rhEPO對高氧肺損傷的保護作用，同時，設立了不同濃度梯度的rhEPO，進一步發(fā)現(xiàn)rhEPO的最適保護濃度為50、100 U/ml，為rhEPO臨床治療高氧肺損傷提供理論依據(jù)。

高氧肺損傷的確切機制至今仍未闡明，也無有效的治療辦法。細胞凋亡是高氧肺損傷的一種主要表現(xiàn)形式［1-2］，紅細胞集落刺激因子中存在著一種重組人促紅細胞生成素（rhEPO），其可刺激集落紅細胞增殖分化，還可在紅細胞生成的過程中，將患者體內(nèi)的非血紅素鐵轉(zhuǎn)移至患者的骨髓，從而減少氧自由基的產(chǎn)生，并采用抗細胞凋亡、促血管生成等多種方式對組織進行保護［3-5］。但是，rhEPO是否對高氧肺損傷有保護作用，目前國內(nèi)外未見詳細報道。故本研究以人肺泡Ⅱ型上皮細胞（A549細胞）為研究對象，高體積分數(shù)氧為處理因素，探討rhEPO是否可以對高氧肺損傷發(fā)揮保護效應，為rhEPO參與高氧肺損傷的預防與治療提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 rhEPO（3 000 U/瓶，成都地奧九泓制藥廠）；A549細胞（西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院中心實驗室）；標準胎牛血清（FCS，天津市灝洋生物制品科技有限責任公司）；超低溫冰箱（FORMA-86C，美國Thermo公司）；流式細胞儀（COULTER EPICS XL，美國Beckman公司）；倒置相差顯微鏡（IX71型，日本Olympys公司）；胰蛋白酶、DMEM高糖培養(yǎng)基、CCK-8（上海碧云天生物技術有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗時間 本研究起止時間為2017年1—12月。

1.2.2 A549細胞的復蘇、培養(yǎng)與傳代 從超低溫冰箱中取出凍存的A549細胞，置入37 ℃溫水中，并對其進行搖晃以促進解凍，吸出細胞懸液，將其加入含有100 ml/L FCS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，混勻后1 000 r/min離心5 min（離心半徑0.5 cm），棄上清液并再次洗滌。使用含100 ml/L FCS的DMEM高糖培養(yǎng)液對細胞懸液進行稀釋并充分混勻，將其接種于100 ml的培養(yǎng)瓶，于37 ℃環(huán)境下靜置12 h，換液后將未貼壁的細胞除去，至貼壁的細胞長滿成片80%以上，再使用2.5 g/L胰蛋白酶對其進行消化和傳代。

1.2.3 實驗分組 取對數(shù)生長期的A549細胞，將其隨機分為對照組、高氧組及10、20、50、100 U/ml rhEPO組，每組中包含8個復孔。將各組已經(jīng)生長至約80%的融合細胞消化成為單個細胞，并按照每個復孔3 000個細胞的原則，將其加入96孔培養(yǎng)板中。實驗前12 h換液以保障細胞能夠同步繁殖，之后于37 ℃、50 ml/L CO2條件下對各組細胞進行處理。（1）對照組處理方法：將細胞置于37 ℃恒溫的50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；（2）高氧組處理方法［6］：以3 L/min速度通過900 ml/L O2和50 ml/L CO2高純混合氣，持續(xù)通氣10 min，之后進行密閉培養(yǎng)；（3）10、20、50、100 U/ml rhEPO組處理方法：分別將細胞加入含10、20、50、100 U/ml rhEPO的培養(yǎng)基，之后預處理24 h，再用高氧誘導。各組細胞均培養(yǎng)24 h。

1.2.4 倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化 采用IX71型倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化并照相。

1.2.5 細胞增殖實驗檢測細胞增殖水平 每孔加入CCK-8溶液10 μl，避光在振蕩機上振蕩2 min，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，在全光譜分光光度計上測定450 nm處吸光度值（OD值），即細胞增殖水平。每組設立8個樣本，按照每組實測數(shù)據(jù)記錄進行統(tǒng)計分析，最終取8個樣本的平均值。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率 根據(jù)凱基生物Annexin V-FITC以及PI雙染試劑盒說明書對細胞凋亡率進行檢測：將密度設定為1×10 cells/ml，將對數(shù)生長期的A549細胞于6孔板內(nèi)進行接種，2 ml/孔，并于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)24 h。24 h后將5% CO2更換為含10% FCS的DMEM高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)連續(xù)培養(yǎng)12 h，使細胞進入靜止期，棄去上清液后收集細胞，加入 500 μl Binding Buffer懸浮細胞和 5 μl Annexin V/FITC混勻，加入5 μl Propidium Iodide混勻；在室溫環(huán)境下進行5～10 min的避光反應，之后使用流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)學變化 對照組細胞排列緊密，連接成片，懸浮細胞數(shù)量較少，扁圓狀多角形，生長狀態(tài)良好；高氧組細胞間空隙較大，細胞受損明顯，活細胞數(shù)量顯著降低，懸浮細胞明顯增多；10、20、50、100 U/ml rhEPO組細胞損傷改善，50、100 U/ml rhEPO組細胞形態(tài)學變化與對照組較為相似（見圖1）。

2.2 細胞增殖水平比較 各組細胞增殖水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高氧組及10、20 U/ml rhEPO組細胞增殖水平小于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；10、20、50、100 U/ml rhEPO組細胞增殖水平大于高氧組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；50、100 U/ml rhEPO組細胞增殖水平大于10、20 U/ml rhEPO組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；100 U/ml rhEPO組細胞增殖水平大于50 U/ml rhEPO組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表1）。

表1 各組細胞增殖水平比較（±s，n=8）Table 1 Comparison of cell proliferation levels in 6 groups

表1 各組細胞增殖水平比較（±s，n=8）Table 1 Comparison of cell proliferation levels in 6 groups

注：rhEPO=重組人促紅細胞生成素；與對照組比較，aP＜0.05；與高氧組比較，bP＜0.05；與10 U/ml rhEPO組比較，cP＜0.05；與20 U/ml rhEPO組比較，dP＜0.05；與50 U/ml rhEPO組比較，eP＜0.05

組別 細胞增殖水平對照組 0.43±0.05高氧組 0.17±0.03a 10 U/ml rhEPO組 0.23±0.02ab 20 U/ml rhEPO組 0.29±0.04ab 50 U/ml rhEPO組 0.37±0.01bcd 100 U/ml rhEPO組 0.41±0.02bcde F值 15.568 P值 0.015

圖1 各組細胞形態(tài)學變化（×100）Figure 1 Morphological changes of cells in 6 groups

2.3 細胞凋亡率比較 各組細胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高氧組及10、20 U/ml rhEPO組細胞凋亡率大于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；10、20、50、100 U/ml rhEPO組細胞凋亡率小于高氧組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；50、100 U/ml rhEPO組細胞凋亡率小于10、20 U/ml rhEPO組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；100 U/ml rhEPO組細胞凋亡率小于50 U/ml rhEPO組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2、圖2）。

表2 各組細胞凋亡率比較（±s，n=8，%）Table 2 Comparison of the apoptosis rate in 6 groups

表2 各組細胞凋亡率比較（±s，n=8，%）Table 2 Comparison of the apoptosis rate in 6 groups

注：與對照組比較，aP＜0.05；與高氧組比較，bP＜0.05；與10 U/ml rhEPO組比較，cP＜0.05；與20 U/ml rhEPO組比較，dP＜0.05；與50 U/ml rhEPO組比較，eP＜0.05

組別 細胞凋亡率對照組 1.67±0.38高氧組 6.13±0.55a 10 U/ml rhEPO組 5.70±0.71ab 20 U/ml rhEPO組 3.83±0.62ab 50 U/ml rhEPO組 2.05±0.53bcd 100 U/ml rhEPO組 1.72±0.49bcde F值 13.675 P值 0.023

3 討論

高氧肺損傷是新生兒重癥監(jiān)護病房（NICU）常見的并發(fā)癥，是長時間吸入高濃度氧導致，可致患兒死亡，該疾病的存活者會發(fā)生肺功能障礙［7］。對于高氧肺損傷的防治，目前采用的方法主要為更換機械通氣模式等保護性通氣策略，效果難以令人滿意，因此尋找一種有效的藥物來阻斷高氧肺損傷迫在眉睫。朱木林等［8］研究發(fā)現(xiàn)，EPO在一氧化碳中毒早期大量表達，發(fā)揮了抗凋亡等神經(jīng)保護作用，使患者無明顯認知改變。也有研究證實，糖蛋白rhEPO可通過升高B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）、降低半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）抑制細胞凋亡，降低新生大鼠發(fā)生壞死性小腸結(jié)腸炎的概率［9］。關于rhEPO對高氧肺損傷患者的肺泡上皮細胞是否具有保護作用，目前研究甚少。為此，本研究探討rhEPO對高氧暴露下A549細胞的形態(tài)、增殖、凋亡的影響，為rhEPO臨床治療高氧肺損傷提供理論依據(jù)。

圖2 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況Figure 2 Cell apoptosis in 6 groups detected by flow cytometry

本研究結(jié)果顯示，對照組細胞排列緊密，連接成片，懸浮細胞數(shù)量較少，扁圓狀多角形，生長狀態(tài)良好；高氧組細胞間空隙較大，細胞受損明顯，活細胞數(shù)量顯著降低，懸浮細胞明顯增多；10、20、50、100 U/ml rhEPO組細胞損傷改善，50、100 U/ml rhEPO組細胞形態(tài)學變化與對照組較為相似；高氧組及10、20 U/ml rhEPO組細胞增殖水平小于對照組，10、20、50、100 U/ml rhEPO組細胞增殖水平大于高氧組，50、100 U/ml rhEPO組細胞增殖水平大于10、20 U/ml rhEPO組，100 U/ml rhEPO組細胞增殖水平大于50 U/ml rhEPO組；高氧組及10、20 U/ml rhEPO組細胞凋亡率大于對照組，10、20、50、100 U/ml rhEPO組細胞凋亡率小于高氧組，50、100 U/ml rhEPO組細胞凋亡率小于10、20 U/ml rhEPO組，100 U/ml rhEPO組細胞凋亡率小于50 U/ml rhEPO組；說明高氧抑制A549細胞增殖、促進A549細胞凋亡，而rhEPO可減輕這種作用，且50、100 U/ml rhEPO能有效抑制A549細胞發(fā)生損傷。rhEPO之所以能夠發(fā)揮以上作用，是因為其能夠與紅細胞生成素受體（EPOR）良好結(jié)合，且rhEPO的生物學效應與EPOR數(shù)量呈正相關，而肺是EPOR的靶器官之一，因此EPOR在肺部細胞表面的數(shù)量是有限的［10］。

本研究局限性：（1）本實驗中僅設立了4個濃度梯度rhEPO，且高氧干預時間為24 h，未來的實驗中要設定更多濃度的rhEPO及不同的高氧干預時間，以了解rhEPO在不同濃度、不同時間高氧暴露下對A549細胞功能的影響。（2）本實驗僅為rhEPO對高氧暴露下A549細胞功能影響的初級實驗，尚未闡明具體分子機制，未來的實驗需深入研究。

綜上所述，高氧抑制A549細胞增殖、促進A549細胞凋亡，而rhEPO可減輕這種作用，且50、100 U/ml rhEPO能有效抑制A549細胞損傷。但rhEPO通過何種機制減輕高氧誘導的A549細胞損傷，尚需進一步研究。

作者貢獻：黨嘉文進行文章的構(gòu)思與設計、實驗的可行性分析、文獻/資料收集與整理，撰寫論文；雷小平、何娜、郭琳進行論文的修訂、英文的修訂；董文斌負責文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負責，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。