藍莓組織培養中污染褐變玻璃化的防止措施

于永梅 王冰 余海英

摘要 在藍莓組培過程中很容易產生污染、褐變、玻璃化等現象，這些都直接限制了藍莓規模化生產。本文總結了藍莓組織培養過程中污染、褐變、玻璃化現象的主要防止措施，以期為藍莓組織培養提供參考。

關鍵詞 藍莓；組織培養；污染；褐變；玻璃化；防止措施

中圖分類號 S633.9 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）10-0105-02

藍莓為多年生小灌木樹種，春季早花，夏季果熟，入秋葉呈紅色，觀賞效果極佳，可作為觀光果園栽培樹種，也可制作盆景；其果實中含有花青素、黃酮等多種多酚類生理活性成分，具有明目、防止腦神經衰老、抗癌、抗氧化等多種生理活性功能，越來越受到消費者的青睞，經濟價值較高，市場潛力巨大，開發前景廣闊。藍莓組培育苗技術的研究，采用藍莓組培快繁技術，短期內獲得大量的無病毒苗木。探討藍莓苗木的工廠化技術育苗體系，有助于我國藍莓產業化發展，滿足社會需求[1-2]。但在藍莓組培過程中，很容易產生污染、褐變、玻璃化等現象，限制了藍莓的組培快繁和大規模生產，是目前急需解決的關鍵問題。筆者總結了藍莓組織培養繁育中常出現的污染、褐變、玻璃化的防止措施，對藍莓苗木的快速繁殖和推廣具有重要意義。

1 污染

1.1 操作人員注意衛生

首先要注意工作人員衛生，工作人員進入無菌室不能吃東西、吸煙等，應常剪指甲。工作服要每周清洗消毒1次，夏季要每3 d清洗消毒1次，工作服滅菌后在緩沖室更換；一次性用品要及時更換，口罩、帽子要經常清洗。進入無菌室前要用肥皂洗手，進入培養室后再用75%酒精對雙手進行消毒[3]。

1.2 改善接種室環境條件

接種室應保持密閉、潔凈；培養室應控制空氣相對濕度在70%左右，濕度太高時可用抽濕機除濕。每次接種前均應清潔接種室的地面，并噴75%酒精沉降灰塵，然后打開紫外燈滅菌20～30 min，紫外燈滅菌結束后，用75%酒精擦洗工作臺面。每次接種結束時，應清潔接種室的地面，并定期清洗無菌操作臺的過濾膜和用甲醛熏蒸接種室[4]。

1.3 對培養基及接種工具徹底滅菌

培養瓶在使用之前要徹底清洗，所用的培養基以及接種過程中使用的器具也要嚴格滅菌。一是培養基滅菌。培養基需要在121 ℃條件下滅菌20～30 min，一般滅菌后的培養基不能放置太久，1～2 d內用完最好，最長不能超過1周，以減少培養瓶污染。二是接種器具滅菌。將接菌器具用報紙、牛皮紙等包扎嚴密，進行高溫高壓滅菌。由于采用的是高壓濕熱滅菌，外層包裹的報紙易破，故要輕拿輕放。一旦報紙、牛皮紙等破裂，滅菌的工具與空氣接觸，就必須重新滅菌[5]。

1.4 嚴格選擇及消毒外植體

一般情況下選擇在春季晴天中午采集外植體，盡量選擇溫室內的植株或新生嫩芽。外植體消毒前先剪掉多余的枝、葉等組織，然后用自來水沖洗表面的灰塵和雜物，大約沖洗30 min。外植體消毒在超凈工作臺上進行，將修剪、沖洗后的外植體放入燒杯中，用洗滌劑水浸泡3 min后，用水沖洗干凈，然后用無菌水沖洗1遍，再用次氯酸鈉或0.1%升汞溶液浸泡10～30 min（視植株品種幼嫩程度而定）消毒，消毒后用無菌水沖洗4～5遍。注意消毒劑對植物有毒害作用，應正確選擇消毒劑的濃度、種類和處理時間，盡量減輕對外植體的傷害。

1.5 合理添加抗生素

在培養基中添加抗生素的主要目的是防止外植體內生菌造成的污染，減少培養材料的損失。但是，在使用抗生素時，必須明確使用的抗生素是否會對培養的植物組織有不良影響以及抗生素抑制的病菌種類、使用濃度和處理時間。因為不存在對所有微生物都有效的抗生素，所以在培養基中添加抗生素只能作為防止污染的輔助措施[4]。

2 褐變

2.1 選擇適當的外植體

不同時期和年齡的外植體在培養中褐變的程度不同。因此，選擇適當的外植體是克服褐變的重要手段。旺盛生長狀態的外植體，分生能力較強，其褐變程度低，是組培的首選材料。Danhua和Carole研究了外植體起源與組織褐變的關系，認為腋生枝的頂芽較其他部位枝的頂芽褐變率低，生長在避蔭處的外植體較全光下的褐變率低[5]。

2.2 對外植體進行預處理

預處理可減輕酚類物質對外植體的毒害作用。外植體經流水處理后，置于冰箱（5 ℃左右）中12～20 h后，先接種到只添加蔗糖的瓊脂培養基中培養5～7 d，使外植體組織中部分酚類物質滲入培養基，然后取出外植體用0.1%氯化汞溶液浸泡10 min，再接種到合適的培養基中培養，可有效抑制褐變。

2.3 選擇合適的培養基和培養條件

培養基中適宜的無機鹽成分、蔗糖濃度、激素組合、激素水平以及抗褐變劑可減輕褐變現象。通過改良WPM培養基有利于抑制外植體的褐變，通過增加瓊脂用量調節培養基硬度，可抑制褐變發生，瓊脂添加量以8 g/L效果最好。在培養基中加入活性炭和VC液都能一定程度地抑制褐變，促進外植體生長，以活性炭的抑制作用較明顯；當綜合運用VC液與活性炭時，以活性炭濃度為100～200 mg/L時，效果最好[6]。在培養過程中要保持適宜的培養條件。培養初期保持在15～20 ℃、黑暗或弱光下培養，可減輕培養材料的褐變[7]。在接種1～2 d后，將外植體轉移至新鮮培養基或同一培養基的不同部位，連續轉移5～6次可防止酚類物質在傷口周圍積累過多，有效防止褐變。

3 玻璃化苗預防措施

3.1 在培養基中適當增加無機營養成分，減少氮素含量

適當增加培養基中鈣、鋅、錳、鉀、鐵、銅、鎂的含量，降低氮和氯的比例，特別是降低銨態氮濃度，提高硝態氮濃度，可減少玻璃化苗的比例[8]。

3.2 適當提高培養基中瓊脂和蔗糖的濃度

適當提高培養基中瓊脂的濃度，可以有效克服藍莓組培苗玻璃化。但若瓊脂濃度過大，會導致培養基過硬，影響養分吸收，造成組培苗生長不良。因此，培養基中瓊脂的濃度以8 g/L較適宜。蔗糖的用量對藍莓組培苗玻璃化現象也有一定影響，綜合考慮組培苗的長勢、節約成本和減少污染等方面，蔗糖用量以25 g/L為宜[9]。

3.3 適當降低細胞分裂素的濃度

在藍莓組織培養中，組培苗玻璃化程度隨著培養基中ZT含量的提高而增加，降低ZT含量，玻璃化苗率顯著降低。但培養基中ZT濃度過低會不利于組培苗的生長分化，ZT 濃度以2 mg/L較適宜[9]。

3.4 增加自然光照，控制光照時間

將玻璃化苗放在自然光下幾天后，莖葉變紅，玻璃化逐漸消失。但是光照時間不宜太長，以8～12 h為宜；光照強度為1 000～1 800 lx時就能滿足藍莓的生長發育要求，并能有效防止玻璃化[8]。

4 參考文獻

[1] 于強波，蘇丹，于立杰，等.藍莓組培育苗技術[J].北方園藝，2010（9）：163-163.

[2] 范兆和.界藍莓生產歷史與發展趨勢[J].落葉果樹，2003（1）：50-52.

[3] 任目瑾，周建峰.植物組織培養的常見污染及其防控技術[J].陜西林業科技，2016（6）：103-105.

[4] 陳玉生，梁秋月，洪向平.植物組織培養污染防治措施[J].廣東農業科學，2008（1）：28-29.

[5] 賈鵬博，姜秀煜，高方.藍莓組織培養污染分析及防治[J].內蒙古林業調查設計，2011（6）：118-119.

[6] 鄭理喬，黃成林，劉華，等.兔眼藍莓組織培養過程中褐化與生根問題的探討[J].安徽農業大學學報，2012，39（5）：777-782.

[7] 陳惠娟.植物組織培養中褐變的產生機理及克服措施[J].植物保護，2005，31（2）：79-82.

[8] 陳世昌.植物組織培養[M].北京：高等教育出版社，2015：89-93.

[9] 畢云，蘇艷，張藝萍，等.藍莓組織培養過程中玻璃化現象的防止技術研究[J].西南農業學報，2014，27 （6）：2539-2542.