羊水樣本卵磷脂和鞘磷脂檢測超高效液相色譜串聯質譜方法的建立及應用

曹 正， 劉京瑞， 謝 鑫， 劉一林， 董 瑩， 唐國棟， 翟燕紅

（1.首都醫科大學附屬北京婦產醫院檢驗科，北京 100026；2.北京奧米科生物科技有限公司實驗室，北京 100094）

新生兒呼吸窘迫綜合征（respiratory distress syndrome，RDS）是由于胎肺未發育成熟，缺乏肺表面活性物質，出生后不久出現呼吸窘迫并進行性加重的臨床綜合征。有調查結果顯示，因胎兒肺部不成熟而造成的新生兒死亡占新生兒總死亡數的70%左右[1]。胎兒呼吸系統是胎兒最晚發育成熟的系統之一，RDS的發病率與孕周呈負相關[2]。正常情況下，在胎肺發育的最后階段（妊娠32周左右），肺表面活性物質的合成會逐漸增加，附著在肺泡上皮細胞的表面活性物質可以降低肺泡表面張力，增加肺的順應性，減輕呼吸肌負擔，從而防止新生兒肺不張[3]。RDS患兒由于表面活性物缺乏，會發生肺萎陷和肺泡過度擴張，甚至發生肺纖維化和肺透明膜病，與之伴隨的還有組織缺氧和呼吸性酸中毒[4]。妊娠28周時，胎兒肺表面活性物質開始由肺泡Ⅱ型細胞合成，并儲存于板層小體（lamellar body，LB）內，LB被分泌出細胞后存在于肺泡表面的液體中，伴隨胎兒的呼吸運動被排到羊水中[5-6]。隨著胎兒的發育，不同磷脂在LB中的比例會發生變化。因此，檢測羊水中各種磷脂的含量可以有效預測胎肺成熟度。常用的預測胎肺成熟度的方法是分析羊水中肺表面活性物質的水平，如采用薄層層析色譜（thin layer chromatography，TLC）法檢測羊水中卵磷脂和鞘磷脂水平并計算卵磷脂/鞘磷脂（lecithin/sphingomyelin，L/S）比值、采用板層小體計數（lamellar body count，LBC）法檢測羊水中LB水平，但這些方法耗時、耗力且效率較低。

近年來，質譜被越來越多地應用于藥物、類固醇、生物胺、氨基酸、有機酸、蛋白質和核糖體RNA等檢測[7]，憑借其高目標物覆蓋范圍、檢測時間短、定量準確等優勢成為各類組學研究的熱門工具[8]。由于卵磷脂、鞘磷脂屬于脂類物質混合物，所以適合在高分辨質譜平臺上同時進行半定量檢測。為此，本研究擬建立超高效液相色譜串聯質譜（ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）快速檢測羊水中卵磷脂和鞘磷脂水平的半定量方法。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2018年1—12月首都醫科大學附屬北京婦產醫院孕期篩查時進行羊水穿刺或分娩得到的羊水樣本30份，-80 ℃保存。行羊水穿刺的孕婦孕周為孕18周，分娩時孕周為孕32～39周。胎肺成熟度判斷以臨床分娩記錄中的新生兒Apgar評分為標準。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 去離子水、甲醇、乙腈、甲酸、異丙醇、甲基叔丁基醚購自美國Fisher Scientific公司，氯仿購自美國Mreda公司，乙酸銨購自美國Sigma-Aldrich公司。內標[神經酰胺（ceramide，Cer）+鞘磷脂（sphingomyelin，Sph）混合液、磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）12：0-13：0、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethoanolamine，P E）1 2：0-1 3：0、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）17：0-20：4]購自美國Avanti Polar Lipids公司。Dionex UltiMate 3000超高效液相色譜儀、Q Exactive四極桿軌道離子阱質譜儀、Savant SPD131DDA SpeedVac型真空離心濃縮儀均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。ACQUITY UPLC BEH C8反向色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm；美國Waters公司）。Skyline定量分析軟件（美國MacCoss公司）。Mix-3000型震蕩混勻器購自杭州米歐儀器有限公司，Mikro 220R型臺式高速冷凍離心機購自德國Hettich公司。

1.2.2 樣本前處理 將羊水樣本置于室溫下的冰快中30～60 min，待樣本融化。取40 μL血清置于1.5 mL離心管中，加入300 μL含內標（Cer、Sph、PC12：0-13：0、PE12：0-13：0、PG17：0-20：4）的甲醇溶液（1 mL混合內標，用甲醇稀釋至6 0 m L），渦旋2 min，加入1 mL甲基叔丁基醚（methyl tertbutyl ether，MTBE） 溶劑，震搖提取1 h，加入250 μL去離子水，混勻。4 ℃條件下13 690×g離心10 min，取600 μL MTBE層溶液，用Savant SPD131DDA SpeedVac型真空離心濃縮儀揮干濃縮，加入100 μL異丙醇和乙腈（1∶1）混合液，震搖復溶，13 690×g離心10 min，取上層溶液置于250 μL內襯管中。

1.2.3 色譜條件 脂質的分離在Dionex UltiMate 3 0 0 0 超高效液相色譜儀上進行，色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C8反向色譜柱，流動相A為乙腈∶水=6∶4（含0.1%甲酸、5 mmol/L乙酸銨），流動相B為異丙醇∶乙腈=9∶1（含0.1%甲酸、5 mmol/L乙酸銨），流速為0.26 mL/min，進樣量為1 μL，柱溫為40℃。梯度洗脫：0 min（100%流動相A），2.0 min（70%流動相A、30%流動相B），12.0 min（30%流動相A、70%流動相B），12.5 min（5%流動相A、95%流動相B），13.0～14.0 min（100%流動相B）。14.1～16.0 min（100%流動相A）。

1.2.4 質譜條件 正離子電壓為3.7 kV，負離子源電壓為3.5 kV，毛細管加熱溫度為320 ℃，溶劑加熱蒸發溫度為300 ℃。鞘氣：氮氣，壓力30 psi；輔助氣：氮氣，壓力10 psi；碰撞氣：氮氣，1.5 mTorr。所有用于質譜分析的氣體均為氮氣。一級全掃描參數：分辨率為70 000，自動增益控制目標為1×106，最大隔離時間為50 ms，質荷比掃描范圍為50～1 500。液質系統控制及數據采集均由Xcalibur 2.2 SP1.48軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司）完成。

1.2.5 數據處理 采集好的數據采用Skyline定量分析軟件（美國MacCoss公司）處理。根據目標代謝物已知加合方式確定的精確相對分子質量和檢測方法已確定的代謝物保留時間設置提取參數，使用分析模型對目標代謝物峰進行積分提取，根據已知內標濃度和內標峰面積定量計算脂質指標水平。卵磷脂總量為64種磷脂峰面積之和，鞘磷脂總量為23種磷脂峰面積之和。

1.2.6 質控 采用質控樣本監測檢測系統的穩定性和重復性。質控樣本由所有樣本移取固定體積并混勻后得到，其前處理方法和待測樣本一致。首先采用5個空白樣本平衡色譜柱，再采用3個質控樣本平衡柱條件，檢測時每間隔5個樣本插入1個質控樣本。

1.2.7 LB檢測 采用XN-2000/3000全自動血液分析儀（日本SYSMEX公司）的血小板通道檢測LB。

1.3 不同方法對胎肺成熟的判斷標準

30份羊水樣本中，有7份采集于孕18周，此時為胎肺極不成熟狀態，因此作為基線對照；采集于孕婦分娩時的23份羊水樣本中，有3份取自胎肺未成熟胎兒母體、20份取自胎肺成熟胎兒母體。根據文獻報道，UPLC-MS/MS以L/S比值＜10為胎肺不成熟，L/S比值≥10為胎肺成熟[9]；LBC法以LB＜50×109/L為胎肺不成熟，LB≥50×109/L為胎肺成熟[10]。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件進行統計分析，呈正態分布的數據以表示，各組間比較采用方差分析。計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 UHPLC-MS/MS的性能

質控樣本的總離子流圖顯示，離子峰強度和保留時間均在可檢測范圍內。見圖1。

6個質控樣本在電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）反相色譜正離子的非監督模式下，主成分分析（principal component analysis，PCA）顯示聚類良好。本法重復性好、性能穩定、數據可靠。見圖2。

圖1 質控樣本的總離子流圖

圖2 質控樣本的PCA圖

2.2 UPLC-MS/MS與LBC法的比較

與基線組比較，胎肺成熟組羊水L/S比值和LB水平均顯著升高（P＜0.05），胎肺不成熟組羊水LB水平顯著升高（P＜0.05），但羊水L/S比值與基線組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組羊水中L/S比值和LB水平的比較

采用UPLC-MS/MS檢測羊水中的卵磷脂和鞘磷脂水平并計算L/S比值，L/S比值判斷胎肺成熟度的敏感性和特異性均達到100%。LBC法對胎肺不成熟羊水樣本有2例錯判，對胎肺成熟樣本有1例錯判，敏感性和特異性分別為80%和95%。2種方法的敏感性和特異性差異均有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

臨床實踐證明，對出生后可能患有RDS的早產兒產前注射糖皮質激素，可以促進肺表面活性物質的合成，使患兒盡早脫離機械通氣，降低RDS的危害程度[11]。因此，為了降低早產兒RDS的發生率，臨床上會對計劃早產的孕婦在產前注射促胎肺成熟藥物，如糖皮質激素等。但使用促肺成熟藥物也可能會引起一些不良后果。有研究結果顯示，胎兒在母體內接觸糖皮質激素可能會對心血管、新陳代謝和神經內分泌功能造成長期損害，導致早產兒出生體質量下降、頭圍變小，并且與長期精神運動發育障礙有一定關聯[12]。因此，有必要對胎兒及時進行胎肺成熟度預測，避免產前過度使用促肺成熟藥物。

LB由90%的磷脂和10%的表面活性蛋白組成。由于LB的大小與血小板相近，所以可以用血液分析儀的血小板通道進行檢測。盡管LBC法簡便易行，但在實際操作中缺乏標準化的質控品，結果也易受血和胎糞污染的影響，而且LB判斷胎肺成熟度的臨界值也存在爭議[13]。

1971年，L/S比值作為最早的評估胎肺成熟度的指標被報道，其與胎肺成熟度有良好的相關關系[14]。卵磷脂含量在孕35周前與鞘磷脂近乎相等，孕35周后其含量迅速增加，成為羊水中肺表面活性物質最主要的成分，鞘磷脂在羊水中的含量雖較低，但在整個晚孕期幾乎不變，可作為卵磷脂的天然參照物[15]。因此在孕35周以前，肺泡表面活性物質中卵磷脂和鞘磷脂的比例近似相等，孕35周以后，L/S比值迅速升高。一般L/S比值＞2.0提示胎肺發育成熟[16]。但有研究結果顯示，當孕婦患有糖尿病時，L/S比值＞2.0并不能準確、有效地判斷出胎肺成熟度[17]。

TLC是一種檢測羊水中L/S比值的手工色譜層析法，大致的步驟是：經過離心等前處理，用溶劑將羊水中的卵磷脂和鞘磷脂展開到薄層色譜板上，以2種磷脂帶對照于標準帶的相對密度來表示L/S比值。TLC法操作繁瑣，耗時耗力，影響因素多，有些實驗步驟甚至存在爭議，難以標準化，實驗室間的數據比對結果顯示其精密度較差[18]，目前市場上無相應的試劑盒，因此已不再被應用于臨床檢測。

當前用質譜方法檢測L/S比值的研究不多。有研究結果顯示，液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LCMS/MS）檢測L/S比值預測胎肺成熟度的臨界值為10，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）檢測L/S比值預測胎肺成熟度的臨界值為9，但由于樣本中實際豐度的原因，研究者只能檢測羊水樣本中豐度較高的6種卵磷脂和1種鞘磷脂[9]。本研究建立的UPLC-MS/MS方法不僅具有大范圍的篩選能力，而且可進行目標定量檢測，分辨率更高，尤其適用于脂質類混合物的分析，其半定量結果來自于64種卵磷脂的豐度之和及23種鞘磷脂的豐度之和，提高了L/S比值的準確性。本法精密度良好，目標范圍內的離子峰強度和保留時間均在可控范圍內。在方法學比對中，本研究以新生兒Apgar評分作為判斷胎肺是否成熟的標準，UPLC-MS/MS以L/S比值=10作為臨界值[19]，LBC法以LB＝50×109/L作為臨界值[10]。結果顯示UPLC-MS/MS的敏感性和特異性均為100%，LBC法的靈感性和特異性分別為80%和95%。提示UPLC-MS/MS可用于預測胎肺成熟度。

本研究的局限性在于樣本量較小。由于臨床會提前進行促肺干預，因此實際能取得的陽性樣本非常少。本研究取得的胎肺未成熟胎兒母體羊水樣本僅有3份。考慮到孕18周的羊水相當于空白基線對照，為胎肺不成熟的極端情況，并且本研究的2種方法是定量或半定量檢測，可以直接檢出羊水中待測物的含量，因此可以與胎肺未成熟檢測樣本一同作為不成熟樣本與成熟樣本進行比對，評價2種檢測方法的敏感性和特異性。本研究檢測的磷脂種類數目與KWAK等[9]檢測的數目有一定差異，因此雖然本研究使用了KWAK等[9]報道的L/S比值的臨界值，但該臨界值是否適用于本研究建立的UPLCMS/MS方法還有待后續大規模樣本的驗證。

綜上所述，UPLC-MS/MS在一定程度上可取代傳統方法來檢測羊水中的L/S比值，用于胎肺成熟度的預測，可在預防新生兒發生RDS的同時，降低過度用藥對孕婦和胎兒造成的負面影響。