LAMP技術(shù)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者外周血EGFR基因L858R位點(diǎn)突變方法的建立及應(yīng)用

鈕 靜， 權(quán)文強(qiáng)， 李 冬

（1.上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 210900；2.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200065）

靶向治療是目前非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）主要的治療手段[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）在NSCLC靶向治療中具有重要作用，其酪氨酸激酶編碼區(qū)基因突變是靶向藥物發(fā)揮作用的必要前提條件[2-4]。因此，進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)在肺癌的靶向治療中顯得尤為重要。但目前用于EGFR基因突變檢測(cè)的方法操作復(fù)雜、檢測(cè)周期長(zhǎng)，且實(shí)驗(yàn)對(duì)象多為組織標(biāo)本，阻礙了EGFR基因突變檢測(cè)在臨床的應(yīng)用。因此，臨床需要建立更加簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是近年來(lái)興起的快速核酸擴(kuò)增技術(shù)，主要利用2對(duì)或3對(duì)特異性引物和具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在恒溫條件下連續(xù)高效擴(kuò)增，具有很高的特異性和敏感性。LAMP技術(shù)操作簡(jiǎn)單，在普通恒溫設(shè)備中就能完成擴(kuò)增，可肉眼直接判讀結(jié)果，非常適合核酸的快速檢測(cè)[5-6]。目前，LAMP技術(shù)已被廣泛用于臨床疾病的診斷、病原微生物的定性檢測(cè)、基因芯片開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域。本研究擬建立一種采用LAMP技術(shù)快速檢測(cè)NSCLC患者EGFR基因21號(hào)外顯子L858R位點(diǎn)突變的即時(shí)檢測(cè)（point-of-care testing，POCT）新方法。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2017年上海市胸科醫(yī)院收治的11例NSCLC患者血漿標(biāo)本，所有患者均排除肺部炎癥性疾病、合并其他原發(fā)腫瘤，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)結(jié)果均為EGFR L858R突變陽(yáng)性。另收集2017年上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院9名體檢健康者血漿標(biāo)本；含有L858R突變的細(xì)胞株H1975和野生型細(xì)胞株A549購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

1.2 儀器與試劑

LA-500環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)濁度儀（日本榮研公司），干式恒溫器（杭州奧盛儀器有限公司），微流控芯片由中國(guó)科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所制作。細(xì)胞DNA提取試劑盒和磁珠法血漿游離DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]，鈣黃綠素（日本榮研公司），Bst DNA聚合酶（美國(guó)NEB公司）。

1.3 方法

1.3.1 LAMP引物設(shè)計(jì) 在Genebank上查找EGFR基因21號(hào)外顯子的DNA序列，查閱相關(guān)文獻(xiàn)確定含有EGFR L858R突變位點(diǎn)的序列位置，利用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer V4上傳目的基因序列，設(shè)計(jì)LAMP反應(yīng)的4條引物F3、B3、FIP、BIP，同時(shí)為了增加LAMP反應(yīng)的特異性，針對(duì)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)了可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的引物P-M及封閉探針PNA-W，F(xiàn)3、B3、FIP、BIP、PNA-W、P-M引物序列分別為5'-GCAGCCAGGAACGTACTG-3'、5'-ACAGCTAGTGGGAAGGCAG-3'、5'-TCTCTTCCGCACCCAGCAGTCACCGCAGCATGTCAAGA-3'、5'-ACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTCCCTGGTGTCAGGAAAATGC-3'、5'-TTGGCCAGCCCAAAATCTGTG-3'、5'-CACAGATTTTGGCCCGCCCAAAATCTGTG-3'。EGFR L858R為野生型，封閉探針PNA-W與之結(jié)合起到封閉作用，P-M無(wú)法與靶序列結(jié)合，抑制DNA擴(kuò)增；EGFR L858R為突變型時(shí)，封閉探針PNA-W無(wú)法結(jié)合，不能起到封閉作用，P-M與靶序列結(jié)合，促進(jìn)DNA擴(kuò)增。擴(kuò)增原理見(jiàn)圖1。

圖1 LAMP擴(kuò)增原理

1.3.2 樣本處理 采用細(xì)胞DNA提取試劑盒提取細(xì)胞株A549、H1975經(jīng)培養(yǎng)收集后的DNA。采用血漿游離DNA提取試劑盒提取11例NSCLC患者血漿和9名體檢健康者血漿cft DNA。

1.3.3 L A M P 反 應(yīng) 體 系 的 建 立 L A M P 反應(yīng)體系包括：2.5 μL緩沖液、1 μL Bst DNA聚合酶（8 000 U/mL）、1.5 μL MgSO4（100 mmol/L）、3.5 μL dNTPs（10 mmol/L）、1 μL F3（5 μmol/L）、1 μL B3（5 μmol/L）、1 μL FIP（40 μmol/L）、1 μL BIP（40 μmol/L）、1 μL P-M（40 μmol/L）、1 μL PNA-W（40 μmol/L）、1 μL 鈣黃綠素、7.5 μL去離子水、2 μL模板DNA，采用干式恒溫器63℃條件下擴(kuò)增60 min，采用熒光目測(cè)和2%瓊脂糖凝膠電泳判讀擴(kuò)增結(jié)果。

1.3.4 LAMP結(jié)果的判讀 選用鈣黃綠素作為熒光指示劑，根據(jù)反應(yīng)結(jié)束后是否有肉眼可見(jiàn)的綠色熒光判斷結(jié)果：出現(xiàn)綠色熒光為陽(yáng)性，沒(méi)有顏色變化為陰性。另取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以驗(yàn)證熒光目測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶為連續(xù)梯狀特異性條帶。

1.3.5 LAMP敏感性驗(yàn)證 用含相同拷貝數(shù)的A549 DNA溶液梯度稀釋H1975 DNA溶液，配置成含有突變負(fù)荷分別為100%、10%、1%、0.1%、0.01%的標(biāo)準(zhǔn)液。通過(guò)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)分析所建立的LAMP方法的敏感性。

1.3.6 LAMP特異性驗(yàn)證 檢測(cè)9名體檢健康者血漿循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），以細(xì)胞株H1975 DNA為陽(yáng)性對(duì)照，A549 DNA為陰性對(duì)照，分析所建立的LAMP方法的特異性。

1.3.7 臨床樣本檢測(cè) 采用數(shù)字PCR檢測(cè)11例EGFR L858R突變陽(yáng)性標(biāo)本，以細(xì)胞株H1975 DNA為陽(yáng)性對(duì)照，A549 DNA為陰性對(duì)照。通過(guò)與數(shù)字PCR結(jié)果進(jìn)行比較來(lái)分析建立的LAMP方法的準(zhǔn)確性。

1.3.8 LAMP與微流控芯片的結(jié)合 設(shè)計(jì)微流控芯片，委托中國(guó)科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所制作。采用微流控芯片結(jié)合LAMP檢測(cè)細(xì)胞株H1975 DNA和A549 DNA，驗(yàn)證本研究設(shè)想的微流控芯片POCT平臺(tái)的可行性。

2 結(jié) 果

2.1 LAMP方法的建立與結(jié)果判讀

2.1.1 熒光目測(cè)結(jié)果 添加突變細(xì)胞株H1975 DNA模板的2號(hào)反應(yīng)管中產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的綠色熒光，判讀為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增陽(yáng)性。1號(hào)、3號(hào)反應(yīng)管分別添加的是野生型細(xì)胞株A549 DNA和水，結(jié)果沒(méi)有顏色變化，判讀為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增陰性。見(jiàn)圖2（a）。

2.1.2 瓊脂糖凝膠電泳 取干式恒溫器擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。可見(jiàn)H1975細(xì)胞株DNA擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)了連續(xù)梯狀特異性條帶，判讀為擴(kuò)增陽(yáng)性；A549細(xì)胞株DNA擴(kuò)增產(chǎn)物因?yàn)橐餄舛容^高出現(xiàn)了引物二聚體，但未出現(xiàn)LAMP連續(xù)梯狀特異性條帶，判讀為擴(kuò)增陰性。見(jiàn)圖2（b）。

圖2 LAMP反應(yīng)結(jié)果

2.2 LAMP敏感性驗(yàn)證

突變負(fù)荷依次為100%、10%、1%、0.1%的4個(gè)管（1、2、3、4號(hào)）內(nèi)均出現(xiàn)綠色熒光，突變負(fù)荷為0.01%的管（5號(hào)）內(nèi)沒(méi)有顏色變化，見(jiàn)圖3（a）。取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，含100%、10%、1%、0.1%突變負(fù)荷標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)了連續(xù)梯狀特異性條帶，含0.01%突變負(fù)荷的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增產(chǎn)物沒(méi)有出現(xiàn)特異性條帶。熒光目測(cè)與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果一致，本方法敏感性達(dá)到0.1%，見(jiàn)圖3（b）。

圖3 LAMP敏感性驗(yàn)證結(jié)果

2.3 LAMP特異性驗(yàn)證

9名體檢健康者血漿標(biāo)本中，采用LAMP法均未檢測(cè)到EGFR L858R突變。本方法特異性達(dá)到100%。見(jiàn)圖4。

圖4 LAMP特異性驗(yàn)證

2.4 臨床樣本檢測(cè)

11例數(shù)字PCR檢測(cè)EGFR L858R突變陽(yáng)性標(biāo)本中，LAMP法檢測(cè)到9例（9/11），另2例突變比例為0.31%和0.24%的突變陽(yáng)性標(biāo)本LAMP檢測(cè)結(jié)果為陰性。見(jiàn)圖5。

圖5 突變陽(yáng)性標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果

2.5 微流控芯片檢測(cè)結(jié)果

本研究制作的微流控芯片包括樣本DNA入口（A）、反應(yīng)液入口（B）、基因擴(kuò)增及檢測(cè)區(qū)（C）、廢液池（D）。將LAMP反應(yīng)液與樣本DNA分別從A、B入口注入芯片，用石蠟油封閉出入口，放入恒溫水浴箱63℃擴(kuò)增60 min。結(jié)果顯示，突變細(xì)胞株H1975 DNA出現(xiàn)綠色熒光，判定為擴(kuò)增陽(yáng)性，野生細(xì)胞株與水沒(méi)有出現(xiàn)綠色熒光，判定為擴(kuò)增陰性。見(jiàn)圖6。

圖6 微流控芯片檢測(cè)結(jié)果

3 討論

近年來(lái)，表皮生長(zhǎng)因子受體-酪氨酸激酶抑制劑 （epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）等靶向藥物已經(jīng)成為晚期NSCLC主要的治療方法。國(guó)內(nèi)外大量研究結(jié)果證實(shí)EGFR基因突變狀態(tài)是患者是否對(duì)EGFR-TKI敏感的強(qiáng)預(yù)測(cè)因子[7-9]。采用靶向治療前應(yīng)做EGFR基因突變檢測(cè)，根據(jù)突變情況選擇靶向藥物，進(jìn)行個(gè)體化治療。

目前，臨床EGFR基因突變的檢測(cè)仍以組織檢查為首選[10]，但臨床腫瘤組織獲取難度較大，且大部分的NSCLC患者在確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)失了手術(shù)切除腫瘤的時(shí)機(jī)，無(wú)法獲取腫瘤組織。以血液中的ctDNA為替代可以很好地解決獲取組織標(biāo)本的局限性。ctDNA是由腫瘤細(xì)胞釋放到血液循環(huán)系統(tǒng)中的游離核酸，與原發(fā)腫瘤的基因組DNA具有相同的遺傳變異特征，能夠特異性地反映腫瘤基因組的信息，且為無(wú)創(chuàng)操作，可以反復(fù)取材，因此在腫瘤的診斷、療效監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷等方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。目前，用于檢測(cè)血液ctNDA EGFR基因突變的方法較多，如突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)、數(shù)字PCR方法、分辨熔點(diǎn)曲線分析法、變性高效液相色譜技術(shù)、二代測(cè)序等[10-11]，但是這些方法操作較為復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件及人員資質(zhì)要求都很高，且需要特殊的檢測(cè)設(shè)備，檢測(cè)費(fèi)用高，使得EGFR基因突變檢測(cè)難以在醫(yī)療條件較差地區(qū)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)能力不高的人群中普及。臨床亟需準(zhǔn)確且經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)平臺(tái)與技術(shù)，使更多的NSCLC患者受益于靶向治療。

本研究利用LAMP技術(shù)建立了血液EGFR L858R基因突變檢測(cè)的方法。該方法不需要特殊檢測(cè)設(shè)備，在干式恒溫器中60 min就能完成擴(kuò)增，選擇鈣黃綠素作為熒光指示劑，直接目測(cè)即可準(zhǔn)確判讀結(jié)果，操作簡(jiǎn)單、成本低廉。此外，本研究建立的LAMP法也具有較好的檢測(cè)性能，針對(duì)含有L858R突變位點(diǎn)靶序列設(shè)計(jì)的LAMP引物及探針能夠特異性地?cái)U(kuò)增突變型細(xì)胞株H1975 DNA，特異性達(dá)到100%，敏感性為0.1%。目前臨床常用的突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)的檢測(cè)敏感性為1%，數(shù)字PCR敏感性為0.1%，與臨床常用方法相比，本研究建立的方法具有較高的敏感性。準(zhǔn)確性方面，數(shù)字PCR檢測(cè)陽(yáng)性的11例標(biāo)本，采用LAMP技術(shù)檢測(cè)到9例陽(yáng)性，有2例突變比例分別為0.31%和0.24%的標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為陰性，原因可能是臨床樣本檢測(cè)時(shí)背景序列比較復(fù)雜，在樣本突變比例較低時(shí)對(duì)本方法檢測(cè)干擾較大。而數(shù)字PCR方法擴(kuò)增前樣本被平均分配到大量反應(yīng)單元中，每個(gè)單元中靶基因以單分子狀態(tài)呈現(xiàn)，背景序列對(duì)檢測(cè)干擾小。此外，也可能與提取的ctDNA質(zhì)量有關(guān)，血漿中ctDNA的含量很低，提取時(shí)游離DNA的降解和血液中細(xì)胞裂解釋放出的基因組DNA都會(huì)影響突變檢測(cè)。由于本研究中獲得的臨床樣本有限，接下來(lái)還需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步進(jìn)行方法學(xué)性能評(píng)價(jià)。我們利用LAMP技術(shù)建立的血液EGFR L858R基因突變檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、特異性強(qiáng)、有較高的敏感性和準(zhǔn)確性，適合臨床NSCLC患者基因突變快速篩查，在基因突變檢測(cè)領(lǐng)域有較大應(yīng)用潛力。

微流控芯片技術(shù)打破了傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室空間、時(shí)間、儀器設(shè)備的限制，提供了一種小而全、高效率、低成本的新型檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)，非常符合目前國(guó)內(nèi)外醫(yī)療領(lǐng)域推行的POCT檢測(cè)模式，應(yīng)用前景非常好。本研究也嘗試建立以微流控芯片為檢測(cè)平臺(tái)的POCT，在設(shè)計(jì)制作的芯片上我們實(shí)現(xiàn)了EGFR L858R突變模板的LAMP，可目測(cè)檢測(cè)結(jié)果，基本實(shí)現(xiàn)了POCT。由于本研究時(shí)間的限制以及目前血漿ctDNA提取的復(fù)雜性，制作的芯片并沒(méi)有整合樣本的提取。在接下來(lái)的研究中我們將繼續(xù)探索制作集樣本提取、反應(yīng)、檢測(cè)于一體的微流控芯片，實(shí)現(xiàn)POCT模式的基因突變快速篩查，推動(dòng)基因突變檢測(cè)在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)及經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)的普及，使更多的癌癥患者受益于靶向治療。