rhMG53作為低溫保護(hù)劑對(duì)小鼠BMSCs生物學(xué)特性的影響

黃團(tuán)結(jié)，馬珊珊，邢 衢，周建康，劉騰飛，周馨魁，王亞蘋(píng)，楊 波，麻建杰，關(guān)方霞1,

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州450052 3)俄亥俄州立大學(xué)Davis心肺研究所外科部 美國(guó)俄亥俄州哥倫布 43210

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有獲取簡(jiǎn)單和易于培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，作為候選的細(xì)胞治療產(chǎn)品要優(yōu)于胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞[1-3]。無(wú)論是基礎(chǔ)研究還是臨床應(yīng)用(如廣泛的退行性疾病和自身免疫疾病等)都需要MSCs有穩(wěn)定的功能和充足的供應(yīng)量。細(xì)胞的低溫冷凍保存優(yōu)勢(shì)明顯且技術(shù)成熟，是目前最常用的細(xì)胞存儲(chǔ)方式[4-5]。在低溫冷凍過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境中冰晶的形成會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜的破損，造成細(xì)胞死亡，而添加合適的低溫保護(hù)劑是目前解決這一問(wèn)題最有效的方式。但是，常規(guī)冷凍保護(hù)劑凍存的干細(xì)胞復(fù)蘇后存活率較低，而且凍存后神經(jīng)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、MSCs等易發(fā)生部分干細(xì)胞特異活性標(biāo)志物的弱化甚至缺失[6-9]。傳統(tǒng)的低溫保護(hù)劑組分存在細(xì)胞毒性或潛在的生物安全性等缺點(diǎn)[6]，因此，開(kāi)發(fā)有效的干細(xì)胞低溫保護(hù)劑組分對(duì)開(kāi)展干細(xì)胞理論研究和臨床應(yīng)用有非常重要的意義。MG53蛋白是近年發(fā)現(xiàn)的在肌肉細(xì)胞中特異性表達(dá)的tripartite motif(TRIM)家族蛋白，具有修復(fù)肌細(xì)胞膜損傷的功能[10]。天然的MG53蛋白主要局限于骨骼肌和心肌組織，但新近發(fā)現(xiàn)在多種非肌肉細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MG53也具有降低細(xì)胞損傷、減少凋亡的作用[11-13]。基因重組的人源性MG53蛋白(rhMG53)可修復(fù)細(xì)胞膜損傷，對(duì)機(jī)械外力、化學(xué)物質(zhì)或紫外線(xiàn)造成的肌肉和非肌肉細(xì)胞的損傷，都表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性的保護(hù)作用，且安全性好[13]。因此，本文旨在探討rhMG53作為低溫保護(hù)劑的特殊組分對(duì)小鼠骨髓MSCs(BMSCs)生物學(xué)特性的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料rhMG53蛋白由美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)麻建杰教授贈(zèng)送。BMSCs購(gòu)于賽業(yè)生物科技有限公司，F(xiàn)BS購(gòu)于Gemini公司，DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶消化液、PBS和青霉素鏈霉素混合液購(gòu)于美國(guó)HyClone公司，CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于日本同仁化學(xué)研究所，臺(tái)盼藍(lán)染色液和蘇木精染色液購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司，DMSO、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、地塞米松、β-磷酸甘油酯、抗壞血酸磷酸酯、氫化可的松、油紅 O和茜素紅S均購(gòu)于Sigma公司，BHA、EGF、N2、B27和bFGF購(gòu)于Peprotech公司，F(xiàn)orskolin和胰島素購(gòu)于阿拉丁公司，RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成，DCX鼠單抗和NSE兔單抗均購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司，Dylight488標(biāo)記的山羊抗鼠二抗、CY3標(biāo)記的山羊抗兔二抗和DAPI染色液購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2BMSCs的分組及凍存將BMSCs懸浮培養(yǎng)于MSCs完全培養(yǎng)基(DMEM/F12培養(yǎng)基、FBS、青霉素鏈霉素體積比為89∶10∶1)中，置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2)中擴(kuò)大培養(yǎng)，隨后均分成兩組做凍存處理。對(duì)照組：凍存液由DMEM/F12培養(yǎng)基、FBS和DMSO以體積比5∶4∶1的比例配制并添加30 g/L的牛血清白蛋白(BSA)；rhMG53組：凍存液同上配制并添加30 mg/L rhMG53蛋白。細(xì)胞凍存密度為1×106個(gè)/mL，采用程序化慢速冷凍法將細(xì)胞保存于液氮中，凍存1 a后復(fù)蘇，進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.3qRT-PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞凍存復(fù)蘇后干性相關(guān)基因mRNA的表達(dá)將凍存復(fù)蘇的兩組細(xì)胞各取1 mL(1×106個(gè))，按RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，按TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板進(jìn)行PCR，引物序列及產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，使用LightCycler 480Ⅱ 7500 Real-Time PCR儀，按“95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)”進(jìn)行反應(yīng)。PCR結(jié)束后，導(dǎo)出Ct值，相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。重復(fù)3次。

表1 干性相關(guān)基因的引物序列

1.4CCK-8法檢測(cè)兩組細(xì)胞的增殖情況將凍存于液氮中的兩組細(xì)胞取出后迅速置于37 ℃水浴鍋中，待細(xì)胞融化后，將干細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，1 000g離心5 min；收集沉淀，用干細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸沉淀，調(diào)整細(xì)胞密度為3×104個(gè)/mL，均勻接種于96孔板，每孔100 μL，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2濃度下培養(yǎng)，分別在12、24、36、48、60、72 h，去除舊培養(yǎng)基，每孔加入90 μL新鮮培養(yǎng)基和10 μL CCK-8，37 ℃下孵育2 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450 nm。重復(fù)3次。

1.5臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)兩組細(xì)胞復(fù)蘇后的存活率將兩組細(xì)胞復(fù)蘇后，在CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后，胰蛋白酶消化細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，適當(dāng)稀釋后將細(xì)胞懸液與4 g/L臺(tái)盼藍(lán)溶液以體積比9∶1 混合，輕輕吹打混勻，染色3 min；吸取適量加有臺(tái)盼藍(lán)染色液的細(xì)胞懸液，滴加于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上并計(jì)數(shù)，死細(xì)胞被染成明砧的藍(lán)色，而活細(xì)胞呈無(wú)色透明狀；細(xì)胞存活率=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.6茜素紅S染色檢測(cè)兩組細(xì)胞成骨分化情況兩組細(xì)胞復(fù)蘇后傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到60%左右時(shí)，更換干細(xì)胞成骨分化培養(yǎng)基(DMEM/F12培養(yǎng)基、100 nmol/L吲哚美辛、10 mmol/L β-磷酸甘油酯和0.5 mmol/L抗壞血酸磷酸酯)，每隔3 d更換一次新鮮培養(yǎng)基，21 d左右觀察細(xì)胞形態(tài)。取分化完成的細(xì)胞制備細(xì)胞涂片，將細(xì)胞涂片在40 g/L多聚甲醛溶液中固定30 min；然后用PBS清洗2次，加入10 g/L茜素紅S染色液(pH 8.3)染色10 min；用PBS沖洗3次，晾干封片，顯微鏡下觀察。染色陽(yáng)性率=(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.7油紅O染色檢測(cè)兩組細(xì)胞成脂分化情況將兩組細(xì)胞復(fù)蘇并經(jīng)傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)60%左右時(shí)，更換干細(xì)胞成脂分化培養(yǎng)基(DMEM/F12培養(yǎng)基、200 μmol/L吲哚美辛、0.5 μmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1 μmol/L地塞米松和1 μmol/L胰島素)，每隔3 d更換一次新鮮培養(yǎng)基，14 d左右觀察細(xì)胞形態(tài)。取分化完成的細(xì)胞制備細(xì)胞涂片，將涂片在40 g/L多聚甲醛溶液中固定30 min；然后，用PBS清洗兩次，加入5 g/L油紅O染色液染色20 min；放入體積分?jǐn)?shù)60%異丙醇溶液中漂洗20 s，流水沖洗，晾干封片，顯微鏡下觀察。染色陽(yáng)性率=(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.8免疫熒光檢測(cè)兩組細(xì)胞成神經(jīng)分化情況將兩組細(xì)胞復(fù)蘇后接種于24孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)60%左右時(shí)，更換含體積分?jǐn)?shù)20% FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基處理24 h；更換含10 μg/L bFGF的DMEM低糖培養(yǎng)基處理24 h；隨后更換神經(jīng)分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(DMEM低糖培養(yǎng)基、體積分?jǐn)?shù)2%DMSO、100 μmol/L BHA、25 mmol/L KCl、10 μmol/L Forskolin、5 mg/L胰島素、1 μmol/L氫化可的松)誘導(dǎo)分化24 h；更換神經(jīng)分化維持誘導(dǎo)培養(yǎng)基(DMEM/F12完全培養(yǎng)基、體積分?jǐn)?shù)10%FBS、10 μg/L EGF、10 μg/L bFGF、1×N2、1×B27)，維持7 d。然后應(yīng)用免疫熒光檢測(cè)DCX和NSE的表達(dá)，步驟見(jiàn)文獻(xiàn)[14]。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)比較兩組細(xì)胞干性相關(guān)基因的表達(dá)、復(fù)蘇后的存活率、茜素紅S和油紅O染色陽(yáng)性率及DCX和NSE陽(yáng)性率的差異。采用2×6析因設(shè)計(jì)的方差分析比較兩組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的增殖情況。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1兩組細(xì)胞OCT4、SOX2和NanogmRNA的表達(dá)情況結(jié)果見(jiàn)表2。兩組細(xì)胞干性相關(guān)基因的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明凍存時(shí)添加rhMG53不影響復(fù)蘇后BMSCs的干性。

表2 兩組細(xì)胞干性相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量比較(n=3)

2.2兩組細(xì)胞的增殖情況結(jié)果見(jiàn)表3。與對(duì)照組相比，rhMG53組細(xì)胞在復(fù)蘇培養(yǎng)24 h后其OD450 nm值升高。

2.3兩組細(xì)胞存活率的比較與對(duì)照組相比，rhMG53組細(xì)胞的存活率升高，見(jiàn)表4。

2.4兩組細(xì)胞成骨、成脂分化及成神經(jīng)分化情況結(jié)果見(jiàn)圖1和表4、5。與對(duì)照組相比，rhMG53組細(xì)胞茜素紅S和油紅O染色陽(yáng)性率及DCX和NSE陽(yáng)性率均有所提高,說(shuō)明rhMG53能促進(jìn)BMSCs的成骨、成脂及成神經(jīng)分化。

表3 兩組細(xì)胞OD值的比較(n=3)

F組間=1 146.933，F(xiàn)時(shí)間=6 196.408，F(xiàn)交互=71.637，P均<0.001；*：與對(duì)照組相比，P<0.001

1：對(duì)照組；2：rhMG53組

表4 兩組細(xì)胞存活率、茜素紅S和油紅O染色陽(yáng)性率比較(n=3) %

表5 兩組細(xì)胞DCX和NSE陽(yáng)性率比較(n=3) %

3 討論

MG53蛋白作為新發(fā)現(xiàn)的一種膜修復(fù)蛋白，已被人們?cè)絹?lái)越熟知。MG53蛋白發(fā)揮膜修復(fù)的機(jī)制[7]為：細(xì)胞損傷后脂質(zhì)暴露，細(xì)胞內(nèi)氧化環(huán)境發(fā)生了變化，MG53能感受這種變化，通過(guò)磷脂酰絲氨酸與細(xì)胞內(nèi)囊泡和細(xì)胞膜結(jié)合；破損的細(xì)胞誘使囊泡向膜破損處轉(zhuǎn)運(yùn)；MG53通過(guò)氧化低聚化的形式相連，最終在鈣離子等相關(guān)因子的作用下使囊泡與破損細(xì)胞膜融合，完成膜修復(fù)。我們的前期研究[15]顯示，外源的rhMG53蛋白對(duì)人臍帶MSCs的氧化膜損傷具有保護(hù)作用。

本研究中，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室前期低溫保護(hù)液組分的基礎(chǔ)上，以膜修復(fù)蛋白rhMG53作為干細(xì)胞低溫保護(hù)劑特殊組分，觀察凍存復(fù)蘇后的干細(xì)胞生物學(xué)特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)rhMG53蛋白對(duì)BMSCs干性相關(guān)基因的表達(dá)無(wú)影響，不影響其干性，而且能提高其凍存復(fù)蘇過(guò)程中的存活率。根據(jù)已有文獻(xiàn)[10]報(bào)道，我們認(rèn)為rhMG53蛋白提高干細(xì)胞凍存復(fù)蘇過(guò)程中的存活率，可能是因?yàn)閮龃鎻?fù)蘇過(guò)程會(huì)造成BMSCs的膜損傷，而rhMG53具有膜修復(fù)作用。我們的結(jié)果還顯示rhMG53能促進(jìn)凍存復(fù)蘇后BMSCs的增殖和成脂、成骨和成神經(jīng)分化效率。根據(jù)已有文獻(xiàn)[16-17]報(bào)道，rhMG53能提高促生存通路相關(guān)蛋白p-AKT、p-GSK3β、p-ERK等的表達(dá)，而PI3K-AKT-GSK3β信號(hào)通路能介導(dǎo)多種信號(hào)因子，是促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖和分化的重要通路。我們推測(cè)促進(jìn)增殖和分化的機(jī)制是rhMG53提高了細(xì)胞生存通路相關(guān)磷酸化蛋白的表達(dá)，進(jìn)而提高了細(xì)胞對(duì)不良環(huán)境的耐受力，增強(qiáng)了干細(xì)胞的活力。

綜上所述，rhMG53蛋白對(duì)低溫冷凍保存的BMSCs具有較好的保護(hù)效果，這為優(yōu)化細(xì)胞冷凍保護(hù)液組分提供了新思路。但是，rhMG53促進(jìn)干細(xì)胞增殖、分化的相關(guān)分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。