黃芪多糖對HCT116細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

王 旗,吳成聲 ,李 輝 ,許業(yè)傳

1)銅陵市立醫(yī)院普外二科 安徽銅陵 244000 2)安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科 合肥 230022

結(jié)直腸癌是一種發(fā)生于消化道系統(tǒng)的常見惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率和病死率呈上升趨勢，嚴(yán)重危害人們的健康和生命[1]。腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移與結(jié)直腸癌患者的生存和預(yù)后密切相關(guān)[2]。黃芪多糖是從豆科植物黃芪干燥根莖中提取的主要活性成分，具有抗病毒、抗輻射、抗腫瘤、抗衰老、抗氧化等多種藥理學(xué)作用[3]。它可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲[4]；能夠抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5]；可逆轉(zhuǎn)食管癌細(xì)胞順鉑耐藥性[6]；能夠抑制視網(wǎng)膜瘤細(xì)胞侵襲[7]。最近有研究[8]顯示，黃芪多糖可抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，并通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究用黃芪多糖干預(yù)體外培養(yǎng)的人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞，檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力以及相關(guān)蛋白水平的變化，探討黃芪多糖影響結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑來源黃芪多糖標(biāo)準(zhǔn)品購于北京索萊寶科技有限公司，純度大于90%；人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116購于美國ATCC細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；胎牛血清、胰蛋白酶購于美國HyClone公司； MTT、二甲基亞砜(DMSO)購于美國Sigma公司；Transwell小室、Matrigel膠購于美國Corning公司；基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo protease，MMP)-2抗體、MMP-9抗體、β-actin抗體及辣根酶標(biāo)記的二抗均購于美國Santa Cruz公司；BCA蛋白定量試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司；ECL發(fā)光檢測試劑盒購于大連寶生物工程有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)HCT116細(xì)胞復(fù)蘇后置于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至約90%匯合度時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，以血清終止消化，吹打離心后，用新鮮完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞進(jìn)行傳代，取傳2～3代后的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3MTT法檢測HCT116細(xì)胞存活率將處于對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞接種于96孔板中，每孔約5×103個細(xì)胞，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞單層貼壁后，分別用含終濃度為0.0(對照)、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L黃芪多糖的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液處理，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入MTT溶液20 μL孵育4 h，棄上清液，加入DMSO 100 μL，置搖床上避光混勻，待沉淀完全溶解后，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值×100%。

1.4劃痕實(shí)驗(yàn)檢測HCT116細(xì)胞遷移能力在超凈工作臺中用封口膜將6孔板封好，在板背面用Marker筆沿其直徑劃平行等距線，備用。收集對數(shù)期生長的HCT116細(xì)胞，接種于劃線的6孔板中，接種密度為4×105個/孔，置于體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至匯合度為80%時，進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)。用移液槍槍頭在垂直于預(yù)先劃線的方向進(jìn)行劃痕，保證槍頭與板垂直，使得劃痕寬度保持一致。劃痕結(jié)束后加適量PBS洗去細(xì)胞碎片，分別加入終濃度為0.0、0.1、0.6 g/L的黃芪多糖，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，測量細(xì)胞遷移距離。遷移抑制率=(對照組遷移距離-實(shí)驗(yàn)組遷移距離)/對照組遷移距離×100%。

1.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測HCT116細(xì)胞侵襲能力胰蛋白酶消化后用不含血清的培養(yǎng)基重懸HCT116細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)整為4×105個/mL。將細(xì)胞懸液加入到上室中，再加入終濃度為0.0(對照)、0.1、0.6 g/L的黃芪多糖，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。下室加入600 μL含血清的DMEM培養(yǎng)基。將Transwell小室置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h取出，用鑷子輕輕取下濾膜，以50 g/L戊二醛4 ℃固定10 min，1 g/L結(jié)晶紫染色30 min，PBS漂洗后拭去未穿過的細(xì)胞及碎片。隨機(jī)選取5個視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。侵襲抑制率=(對照組侵襲細(xì)胞數(shù)-實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù))/對照組侵襲細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6Westernblot檢測HCT116細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)將對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，換液后加入終濃度為0.0、0.1、0.6 g/L的黃芪多糖繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞。分別加入裂解液置冰上裂解10 min，以12 000 r/min離心10 min，提取細(xì)胞總蛋白。以BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后，將蛋白與上樣緩沖液按體積比4∶1進(jìn)行混合，置于沸水中加熱變性，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。采用半干法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，在含50 g/L的脫脂奶粉封閉液中封閉4 h。分別加入MMP-2一抗(1∶1 000倍稀釋)、MMP-9一抗(1∶800倍稀釋)，4 ℃搖床上孵育過夜，TBS洗滌3次，加入二抗(1∶1 500倍稀釋)，室溫孵育2 h。TBS洗滌3次，以ECL試劑盒進(jìn)行發(fā)光，于暗室中經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描，采用Image J圖像分析系統(tǒng)分析條帶灰度值，以MMP-2、MMP-9條帶與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示MMP-2、MMP-9蛋白的相對表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0進(jìn)行分析，以單因素方差分析和兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較各組HCT116細(xì)胞存活率、遷移和侵襲能力、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1黃芪多糖對HCT116細(xì)胞存活率的影響結(jié)果見表1。當(dāng)黃芪多糖濃度為0.8和1.0 g/L時，HCT116細(xì)胞存活率低于70%。故選擇0.1、0.6 g/L的黃芪多糖用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 不同濃度的黃芪多糖對HCT116細(xì)胞存活率的影響

F=301.705，P<0.001；組間兩兩比較，P<0.05

2.2黃芪多糖對HCT116細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響結(jié)果見表2、3，黃芪多糖能夠抑制HCT116細(xì)胞的遷移和侵襲，抑制作用隨濃度的升高而增強(qiáng)。

表2 3組HCT116細(xì)胞遷移能力的比較

*：與0.0 g/L黃芪多糖組比較，P<0.05；#：與0.1 g/L黃芪多糖組比較，P<0.05

表3 3組HCT116細(xì)胞侵襲能力的比較

*：與0 g/L組比較，P<0.05；#：與0.1 g/L黃芪多糖組比較，P<0.05

2.3黃芪多糖對HCT116細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平的影響結(jié)果見圖1和表4，黃芪多糖劑量依賴性地抑制HCT116細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)。

1、2、3：分別為0.0、0.1和0.6 g/L黃芪多糖組

ρ(黃芪多糖)/(g/L)nMMP-2MMP-90.030.54±0.060.92±0.110.130.33±0.04*0.52±0.06*0.630.14±0.02*#0.27±0.03*#F64.33958.283P<0.001<0.001

*：與0.0 g/L黃芪多糖組比較，P<0.05；#：與0.1 g/L黃芪多糖組比較，P<0.05

3 討論

結(jié)直腸癌是臨床上常見的胃腸道惡性腫瘤之一，受飲食、遺傳、環(huán)境等因素的影響，其發(fā)病率逐年上升[9]。尋找高效低毒的抗癌藥物是腫瘤治療的熱點(diǎn)及難點(diǎn)[10-12]。黃芪多糖是黃芪的主要活性成分。相關(guān)研究[13-15]顯示，黃芪多糖能夠通過多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，阻滯腫瘤細(xì)胞周期的進(jìn)程，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。作者通過MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)選取0.1和0.6 g/L的黃芪多糖干預(yù)HCT116細(xì)胞，探究黃芪多糖對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響及其作用機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可抑制HCT116細(xì)胞的遷移和侵襲。這與Wu等[17]的研究相似，他們發(fā)現(xiàn)黃芪多糖通過抑制NF-κB活性，抑制人肺癌細(xì)胞A549的轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抗腫瘤活性。黃芪多糖還通過抑制AKT信號通路抑制胃癌AGS細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。MMP-2和MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中主要成員，主要功能是降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)[19]。目前研究[20]證實(shí)MMP-2和MMP-9活性或表達(dá)水平升高時，乳腺癌細(xì)胞表現(xiàn)出較高的侵襲性和轉(zhuǎn)移性。結(jié)直腸癌的惡性生物學(xué)表型及預(yù)后與MMP-2和MMP-9的表達(dá)緊密相關(guān)，且結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移與MMP-2和MMP-9有關(guān)[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芪多糖能夠顯著下調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平。

總之，黃芪多糖能夠顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移，其作用機(jī)制與下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)有關(guān)。