實(shí)驗性自身免疫性重癥肌無力大鼠多肌群SNX17基因的表達(dá)

張艷停，呂 杰，趙 雪，張迎娜，方 華，李倩如，杜 英，張清勇，楊俊紅，張運(yùn)克，高 峰，李 昕

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450014 2)鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院神經(jīng)免疫學(xué)研究室 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系 鄭州 450001 4)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院普胸外科 鄭州 450014 5)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病科 鄭州 450000 6)河南中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院康復(fù)辦公室 鄭州 450000

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是一種主要累及神經(jīng)肌肉接頭(neuromuscular junction，NMJ)突觸后膜(終板膜)的獲得性自身免疫性疾病，其特征為朝輕暮重[1]，人群患病率約50/10萬[2]。研究結(jié)果[3-4]表明，分揀微管連接蛋白17(sorting nexin 17，SNX17)參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞表面蛋白內(nèi)吞、胞內(nèi)分選過程，并通過其FERM-like基元與低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1(low density lipoprotein receptor-related protein 1，LRP1)、P-選擇素和載脂蛋白2(the ε2 isoform of ApoE，ApoER2)等多種膜蛋白胞內(nèi)域NPxY基元結(jié)合，促進(jìn)這些膜蛋白高效率循環(huán)再利用到細(xì)胞膜[5-6]。LRP4是最近發(fā)現(xiàn)的參與NMJ乙酰膽堿受體(acetylcholine receptors，AChR)聚集的關(guān)鍵聚集蛋白受體，與肌肉特異性受體酪氨酸激酶(muscle specific kinase，MuSK)、煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic Acetylcholine receptor，nAChR) 共同組成運(yùn)動終板膜特有的功能單位(LRP4-MuSK-nAChR Uint，LMA)，在神經(jīng)肌肉興奮化學(xué)傳遞中發(fā)揮重要作用。課題組前期研究[7]發(fā)現(xiàn)MG患者肋間肌肌細(xì)胞中SNX17含量明顯增高，并與AChR共定位于NMJ處，通過雙向免疫共沉淀(Co-IP)及Western blot驗證了原核表達(dá)的LRP4胞內(nèi)區(qū)蛋白與真核表達(dá)的SNX17體外可直接結(jié)合，推測LRP4在MG患者NMJ處肌細(xì)胞內(nèi)通過與SNX17結(jié)合，逃避溶酶體降解，實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)的循環(huán)再利用[8]。本實(shí)驗用人工合成的鼠源性AChR-α亞基97～116肽段建立實(shí)驗性自身免疫性重癥肌無力(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)大鼠模型，采用qRT-PCR、Western blot檢測SNX17 mRNA、蛋白的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1材料與試劑健康雌性lewis大鼠(北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司)；鼠源性AChR-α亞基97～116肽段(來自Gene Norway rat)由上海淘普生物科技有限公司合成，序列號為DGDFAIVKFTKVLLDYTGHI(20aa)；完全福氏佐劑(CFA)、不完全福氏佐劑(IFA)(美國Sigma公司)；qRT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)；小鼠抗大鼠SNX17抗體(美國Santa Cruz公司)，兔抗鼠GAPDH(杭州賢侄生物科技有限公司 )，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠和羊抗兔抗體(北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。

1.2實(shí)驗分組及EAMG大鼠模型的建立將20只大鼠(6～8周，體重150～160 g)按隨機(jī)數(shù)字法分為正常對照組和實(shí)驗組，每組各10只。采用人工合成鼠源性AChR-α亞基97～116肽段為免疫原誘導(dǎo)實(shí)驗組大鼠建立動物模型。初次免疫制成乳劑200 μL(采用CFA)，含鼠源性AChR-α亞基97～116肽段100 μg，在大鼠的背部4點(diǎn)及雙足墊注射(背部每點(diǎn)40 μL，足墊每點(diǎn)20 μL)，第2、第3次免疫分別于初次免疫后第30天及第45天同等部位給予同等劑量免疫(采用IFA)。第3次免疫一周后開始評價模型。以Lennon分級評分≥1分[9]，ELISA法測定大鼠血清AChRAb 呈陽性，同時低頻(5Hz)重復(fù)電刺激后，腓腸肌肌電圖在第5次出現(xiàn)衰減幅度大于10%為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。正常對照組給予同等劑量的佐劑與PBS。本實(shí)驗內(nèi)容及過程已通過鄭州大學(xué)生命科學(xué)倫理審查委員會的審核。

1.3 2組大鼠肌細(xì)胞中SNX17、AChRβ亞型mRNA含量的qRT-PCR法檢測體積分?jǐn)?shù)5%水合氯醛麻醉大鼠，取出各肌群肌肉組織，預(yù)冷PBS洗滌2 次，每組肌群各稱取40 mg肌肉液氮下勻漿，用Trizol一步法提取RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。用Premier 5.0設(shè)計引物，SNX17上游引物序列5’-GACGACGATGTCATG GAGAA-3’，下游引物序列5’-AGATTTGAGCT GTCGGTGCT-3’；nAChR上游引物序列5’-AGCCT GAACGAGAAGGATGA-3’，下游引物序列5’-TGA CACGGAGAGACTCGATG-3’；內(nèi)參β-actin上游引物序列5’-TGTCACCAACTGGGACGATA-3’，下游引物序列5’-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3’；均由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計并合成。qRT-PCR采用20 μL的反應(yīng)體系，熒光預(yù)變性反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s；PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 s、55 ℃ 30 s，45個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。

1.4 2組大鼠肌細(xì)胞中SNX17蛋白含量的Westernblot檢測取上述肌肉組織，分別加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r/min離心5 min后取上清，BCA法測蛋白濃度，每孔加5 μL樣品，以GAPDH作為內(nèi)參，小鼠抗大鼠SNX17抗體(按1∶500稀釋)及兔抗鼠GAPDH抗體(按1∶1 000稀釋)作為一抗4 ℃孵育過夜，37 ℃復(fù)溫30 min，加HRP標(biāo)記的羊抗小鼠抗體(按1∶10 000稀釋)和 HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體(按1∶10 000稀釋)37 ℃孵育1 h，曝光，采用圖像分析軟件Quantity One測定各條帶灰度值，以目的條帶和內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，應(yīng)用兩獨(dú)立樣本的t檢驗比較2組大鼠不同肌群中SNX17、nAChR mRNA和SNX17蛋白含量的差異，相關(guān)性分析應(yīng)用Pearson相關(guān)分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1EAMG實(shí)驗大鼠模型的建立實(shí)驗組多只大鼠在首次免疫第7周后出現(xiàn)活動減少，撕咬無力，反應(yīng)遲鈍，容易疲勞等癥狀，最終8只建模成功。

2.2 2組大鼠不同肌群中SNX17和nAChRmRNA含量比較見表1和2。與正常對照組相比，EAMG組大鼠心肌、肋間肌中SNX17 mRNA的表達(dá)升高(P<0.05)，膈肌中SNX17 mRNA的表達(dá)降低(P<0.05)；胸鎖乳突肌、腓腸肌和眼肌中nAChR mRNA的表達(dá)降低(P<0.05)，心肌中nAChR mRNA的表達(dá)升高(P<0.05)。

2.3 2組大鼠不同肌群中SNX17蛋白含量比較見表3。與正常對照組相比，EAMG組大鼠咬肌、心肌、腓腸肌中SNX17蛋白含量表達(dá)增加，而在胸鎖乳突肌、膈肌表達(dá)降低(P<0.05)。

2.4EAMG組大鼠不同肌群中SNX17與nAChRmRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析Pearson相關(guān)分析顯示，EAMG組腓腸肌中SNX17 mRNA與nAchR mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.773，P=0.035)，在心肌中兩者間的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.947，P=0.012) ；其余肌群中二者的表達(dá)無相關(guān)性。

表1 2組大鼠不同肌群中SNX17 mRNA含量比較

表2 2組大鼠不同肌群中nAChR mRNA含量比較

表3 2組大鼠不同肌群中SNX17 蛋白含量比較

3 討論

SNXs是涉及細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)牡鞍踪|(zhì)家族。該家族的特征是存在phox(PX)同源結(jié)構(gòu)域，并已被證明能夠與磷脂酰肌醇磷酸酯(PtdInsP)結(jié)合。SNX17是SNXs家族中的成員，是首先被確定為細(xì)胞黏附蛋白——P-選擇蛋白的細(xì)胞質(zhì)尾部的結(jié)合伴侶。與許多SNX類似，SNX17定位于早期內(nèi)體。已有研究[3-4]表明SNX17介導(dǎo)多種細(xì)胞表面蛋白內(nèi)化、再循環(huán)及降解，包括P-選擇蛋白、淀粉樣蛋白前體蛋白、整聯(lián)蛋白α1、 LDLR、LRP1、ApoER2和FEEL1等。SNX17還含有4.1/ezrin/radixin/moesin(FERM)結(jié)構(gòu)域，可與P-選擇蛋白相互作用，一方面加速其胞膜內(nèi)吞， 另一方面又阻止其向溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)，從而減緩其降解[10]。

MG是T 細(xì)胞依賴的、抗體介導(dǎo)的自身免疫性疾病，根據(jù)胸腺病理分型可分為胸腺增生和胸腺瘤，其病理特征為突觸后膜皺褶減少、縮短、簡單化、AChR數(shù)量減少。有研究[11-12]報道MG患者治療前T 細(xì)胞亞群紊亂明顯者，即CD8+百分比下降、CD4+/CD8+升高明顯者，經(jīng)糖皮質(zhì)激素及胸腺擴(kuò)大切除術(shù)治療后效果較好，且胸腺切除術(shù)后患者的甲狀腺功能紊亂得到糾正。還有研究[13]表明MG主要與AChR抗體、MuSK抗體和LRP4抗體3種自身抗體有關(guān)；生理情況下，LRP4結(jié)合聚集蛋白，促進(jìn)MuSK發(fā)生酪氨酸磷酸化，誘導(dǎo)nAChR聚集于終板膜，使神經(jīng)沖動正常傳導(dǎo)[14-15]。

EAMG模型可經(jīng)乙酰膽堿受體主動免疫注射[16]或被動接種抗乙酰膽堿受體抗體誘導(dǎo)而制得[17-18]。作者采用主動免疫法成功構(gòu)建了EAMG模型，為研究MG的發(fā)病機(jī)制、血清學(xué)診斷及免疫治療等開辟了有效的途徑。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組相比，EAMG組大鼠心肌SNX17 mRNA和蛋白的表達(dá)升高，膈肌中SNX17 mRNA和蛋白的表達(dá)降低，該結(jié)果解釋了MG患者的部分臨床特點(diǎn)，即常常是某一組或幾組肌群受累，單純累及眼肌的發(fā)病率最高，也可累及咬肌、四肢肌等肌群；而心肌重要臟器肌肉組織可能通過機(jī)體代償機(jī)制調(diào)節(jié)，很少被累及。EAMG組腓腸肌中SNX17 mRNA與nAchR mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而在心肌中兩者間的表達(dá)呈正相關(guān)，提示SNX17可能是NMJ處的關(guān)鍵蛋白。但鑒于研究的樣本量較少，需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步明確兩者間的關(guān)系。

綜上所述，SNX17和nAChR在EAMG不同肌群中的表達(dá)水平不同，且二者在心肌的表達(dá)呈正相關(guān)，提示SNX17對預(yù)防自身抗體引發(fā)MS危象和心臟驟停具有重要作用；而參與呼吸運(yùn)動的膈肌上述分子的表達(dá)較低，其原因還需要進(jìn)一步研究。