miR-210基因表達和多態性與肺癌易感性的關系

徐勇超，丁明翠，馮曉蕾，段曉冉，王彭彭，劉 斌，張 輝，魏 婉，王 威

鄭州大學公共衛生學院勞動衛生與職業病學教研室 鄭州 450001

目前，肺癌的發病率和病死率均居于我國惡性腫瘤之首[1-2]。早期肺癌患者無特異的臨床癥狀，且缺乏有效的診斷手段，約75%的肺癌患者在確診時已是晚期，而晚期肺癌患者的5 a生存率僅為15%左右[3]。因此，需要開展肺癌早期診斷生物標志物研究。成熟的微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度為20～24個核苷酸的內源性非編碼RNA。miRNA能在轉錄后水平調節一系列腫瘤相關基因的表達，進一步影響細胞周期調控，從而影響腫瘤的發生和發展[4]。miR-210的編碼基因位于染色體11p15.5，研究[5]發現miR-210可以調節細胞的增殖、分化，促進血管生成、免疫調節和心肌能量代謝等，在各種生物過程中均發揮著重要的作用。研究[6-7]表明，miR-210在肺癌組織中的表達水平高于正常組織，可能與肺癌發病相關；非小細胞肺癌患者血漿miR-210表達水平高于正常對照組，說明血漿miR-210可能是非小細胞肺癌早期診斷潛在的血液生物標志物。該研究探討了人外周血血漿中miR-210基因表達及其多態性與肺癌易感性的關系。

1 對象與方法

1.1研究對象肺癌組來源于2016年6月至2017年2月在鄭州大學第一附屬醫院、河南省腫瘤醫院、河南省胸科醫院就診，且經過病理組織學確診的137例原發性肺癌患者；年齡29～87歲；其中小細胞癌17例，鱗癌35例，腺癌61例，大細胞癌2例，其他類型22例。對照組為2016年7月在河南省某醫院體檢健康的141人，年齡36～76歲。

1.2一般資料的收集研究對象知情同意后，采用設計好的調查問卷通過面對面訪談的方式進行調查。調查問卷的內容主要包括流行病學資料(年齡、性別、吸煙、飲酒、個人疾病史、癌癥家族史等)、肺癌患者的臨床臨床癥狀資料(咯血、發熱、胸悶、胸痛、痰中帶血、乏力咳嗽)和臨床病理特征資料(組織學類型、TNM分期、淋巴結轉移、遠端轉移)。吸煙的定義為每天1支或以上，連續吸煙6個月或以上。飲酒的定義為每周至少飲酒1次，每次折合成純乙醇20 g以上。

1.3血漿miR-210表達水平的檢測嚴格按照miRcute miRNA提取分離試劑盒(DP501型，北京天根生化科技有限公司)操作說明進行血漿中miRNAs富集部分的提取；采用qRT-PCR技術(7500 Fast Real-time PCR儀,美國ABI公司)檢測血漿中miR-210表達水平，采用DYY-8C型電泳儀(北京六一儀器廠)對擴增產物進行定性檢測。采用無人體內源性表達的線蟲的某miRNA(CR100，北京天根生化科技有限公司)為外參。miRNA表達水平采用2-ΔΔCt計算[8]：ΔCt=Ct目標-Ct外參，ΔΔCt=ΔCt目標-ΔCt對照平均。

1.4miR-210基因多態性檢測結合文獻資料選擇miR-210基因的SNPs，最終納入rs11246190、rs12364149、rs7395206和rs7395908，這4個SNPs的基本信息及引物序列見表1。嚴格按照全基因組DNA提取試劑盒(北京百泰克生物科技有限公司)說明進行外周血白細胞基因組DNA的提取。DNA樣本送至北京博淼生物科技有限公司，采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術(美國Sequenom公司MassArray系統)檢測基因型。

表1 4個SNPs基本信息及其引物序列

1.5統計學處理采用SPSS 21.0對數據進行分析。2組性別、年齡構成及吸煙飲酒狀況的比較采用χ2檢驗，血漿miR-210表達水平的比較采用秩和檢驗；采用Hardy-Weinberg平衡分析對照人群基因型頻率分布情況；通過建立logistic回歸模型分析肺癌患病的影響因素。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1兩組一般情況的比較兩組年齡、性別構成及吸煙、飲酒情況差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 2組研究對象的一般資料的比較 例

2.2兩組血漿miR-210表達水平的比較肺癌組與對照組miR-210表達水平分別為1.18(0.58,3.08)和0.71(0.39,1.26)，差異有統計學意義(Z=4.421，P<0.001)。

2.3兩組miR-210的4個SNPs位點的多態性分布及與肺癌的關系在對照組中，除rs11246190外，其他3個位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，說明所選樣本具有群體代表性。部分DNA樣本無法擴增，導致樣本量有減少。因rs11246190位點GG型在肺癌組中只檢測到1例，在對照組中只檢測到2例，因此將GG和AG型合并分析；rs12364149位點GG型在對照組中只檢測到4例，因此將CG和GG型合并分析。肺癌組和對照組4個位點的多態性分布見表3。結果顯示，兩組rs11246190基因型頻率差異有統計學意義(P<0.05)，AA型攜帶者患肺癌的風險顯著增加(OR=1.967，95%CI=1.124～3.443)。兩組其他3個位點的基因型頻率分布差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4肺癌患病影響因素分析以組別為因變量(對照為0，肺癌為1)，以年齡(<60歲=1，≥60歲=2)、性別(男=1，女=2)、吸煙(否=0，是=1)、飲酒(否=0，是=1)、miR-210表達水平(等級資料)、rs7395206基因型(CC=1，CT=2，TT=3)、rs12364149基因型(CC=1，CG+GG=2)、rs11246190基因型(AG+GG=1，AA=2)為自變量，進行logistic回歸分析，結果(表4)顯示，吸煙、miR-210表達水平升高、rs11246190 AA基因型攜帶者肺癌患病風險升高。

表3 2組miR-210基因型分布 例(%)

表4 Logistic回歸分析

3 討論

研究[9-10]發現miR-210在肺癌患者中表達水平高于正常對照，且與淋巴結轉移、不良預后、肺癌分期有關。Pak等[11]研究發現，肺癌晚期A549細胞中miR-210存在高表達，且miR-210的表達水平與腫瘤大小、TNM分期呈正相關。Daugaard等[12]發現，淋巴結轉移陽性的肺腺癌患者血漿中miR-210表達水平高于淋巴結轉移陰性者。本研究發現肺癌患者血漿miR-210的表達水平高于正常對照，提示miR-210表達與肺癌發生有關。

miRNA的SNPs可以分為兩大類[13]：一類位于初始轉錄本和前體miRNA，這類SNPs通過影響miRNA的生物學功能，從而影響成熟miRNA的表達水平。一類SNPs可以通過影響miRNA識別靶mRNA的能力，從而影響miRNA的表達水平及其生物學功能。越來越多的研究[14-15]表明，肺癌的發生發展可能與miRNA上的SNPs位點有關，但絕大多數都是關于miR-196和miR-146與肺癌關系的報道，目前還未見miR-210多態性與肺癌易感性的相關報道。因此，該研究對miR-210基因4個SNPs與肺癌易感性的關系進行了探討。結果顯示，rs11246190在肺癌組和對照組間的基因型頻率分布有差異，rs11246190 AA基因型攜帶者患肺癌的風險增加。

大量的流行病學研究[16]顯示，吸煙是肺癌發生發展的重要危險因素，且兩者之間存在一定的劑量-效應關系。有研究[17]發現，香煙煙霧暴露可以導致大鼠肺組織中miRNAs表達異常，從而導致細胞周期調控發生紊亂；且超過一半的編碼miRNA的基因位于基因組的脆性位點或區域，miRNAs的遺傳改變可能促進靶基因的表達改變，加速細胞的惡性轉化[18]。Logistic回歸結果顯示，吸煙人群患肺癌的風險顯著升高(OR=2.495)，與上述研究結果一致，提示吸煙是肺癌的易感因素；血漿miR-210表達水平升高者患肺癌風險增加(OR=1.123)，且miR-210 rs11246190位點AA基因型攜帶者患肺癌的風險為AG+GG基因型的2.479倍，提示血漿miR-210高表達和rs11246190位點AA基因型與肺癌易感性有關系。

綜上所述，血漿miR-210表達水平以及miR-210基因 rs11246190多態可能與肺癌的發病有關，但miR-210表達和基因多態性與肺癌發病機制的關系還需進一步探討。