THBS1表達上調(diào)對肺腺癌細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響

王曉慧，刁長英，謝藝林，劉亞清，高獻爭，韓 靜，李晟磊，劉紅濤

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院病理科 鄭州 450052 2)鄭州大學生命科學院細胞生物學研究室 鄭州 450001

肺癌是全世界癌癥死亡的首要原因[1]。肺癌中非小細胞癌進展快、侵襲力強、死亡率高。目前非小細胞肺癌分子機制和治療的研究已經(jīng)成為現(xiàn)階段醫(yī)學研究的熱點。血小板凝血酶蛋白家族(thrombospondin，THBS)是最初發(fā)現(xiàn)于血小板中的糖蛋白，但也可以由許多正常和轉化的細胞合成和分泌。THBS1 是該家族中第一個被確定的成員，是一種相對分子質(zhì)量大約為450 000的三聚體同源復合物，能夠介導細胞與細胞、細胞與基質(zhì)之間的作用，并參與調(diào)節(jié)腫瘤的進展與轉移[2]。有研究[3-4]提出THBS1在腫瘤增殖、侵襲中具有重要作用，其異常表達可能與腫瘤的生長關系密切。我們通過構建 THBS1真核表達載體，以脂質(zhì)體法轉染入肺腺癌細胞，觀察癌細胞中THBS1表達的變化及其對肺腺癌細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1細胞株與主要試劑肺腺癌細胞株A549、H1299、H358、H1975、PC9、PG49和Calu3均從美國ATCC購買，均培養(yǎng)在RPMI 1640培養(yǎng)基中，并補充體積分數(shù)10%的胎牛血清。RPMI 1640和胎牛血清購自美國Gibco公司；Trizol 試劑購自北京雷根生物技術有限公司；pcDNA3.1購自美國Invitrogen公司；T4 DNA連接酶購自美國NEB公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；反轉錄試劑盒ReverTra Ace Qpcr RT Master mix 購自日本TOYOBO公司；SYBR PremixEx Taq Ⅱ(Tli RnaseH Plus)購自日本TaKaRa公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、HindⅢ和XbaⅠ購自大連寶生物科技有限公司；DH5α感受態(tài)細菌、質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；BSA和DMSO購自美國Sigma公司；CCK-8試劑購自中國碧云天生物科技有限公司。

1.2肺腺癌細胞中THBS1mRNA的檢測采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測。按照Trizol試劑說明提取肺腺癌細胞總RNA，用微量紫外分光光度計測量RNA濃度，并判定其純度。用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，按照qRT-PCR試劑盒說明進行擴增，反應結束后確認擴增曲線和溶解曲線，嚴格按照試劑盒說明書進行結果判讀。采用2-ΔΔCt法計算THBS1 mRNA表達量。

1.3pcDNA3.1-THBS1真核表達載體的構建擴增A549細胞DNA，按回收試劑盒操作說明回收特異PCR產(chǎn)物。采用HindⅢ和XbaⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1空載體，電泳后膠回收酶切產(chǎn)物目的片段，連接酶連接目的片段后轉化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒并進行PCR、測序鑒定，鑒定正確者即為pcDNA3.1-THBS1。

1.4轉染pcDNA3.1-THBS1對肺腺癌細胞H1975增殖、凋亡和細胞周期的影響

1.4.1 實驗分組 將H1975細胞接種至25 cm2的培養(yǎng)瓶中，并加入含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，待細胞生長狀態(tài)良好，用胰蛋白酶消化，接種至6孔板中。實驗設3組。空白對照組不做處理；pcDNA3.1組和pcDNA-THBS1組細胞按照LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)操作說明分別轉染空載體pcDNA3.1和pcDNA-THBS1。

1.4.2 細胞中THBS1 mRNA的檢測 轉染48 h后采用qRT-PCR法檢測細胞中THBS1 mRNA的表達，方法同1.2。每組3個復孔。

1.4.3 細胞增殖檢測 轉染48 h后，將3組細胞分別接種至96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24、48、72和96 h后，加入CCK-8試劑2 h，然后在酶標儀上測定450 nm處的吸光度值。每組均3個復孔。

1.4.4 細胞凋亡檢測 轉染48 h后收獲3組細胞，調(diào)整細胞密度為5×106個/mL，取500 μL用PBS漂洗，重懸，避光保存，2 000 r/min 離心5 min，PBS漂洗，加入熒光溶液(SA-FLOUS)1 h后懸浮，上流式細胞儀檢測。每組均3個復孔。

1.4.5 細胞周期分布 3組細胞培養(yǎng)48 h，2 000 r/min離心5 min，調(diào)整細胞密度為1×106個/mL，胰蛋白酶充分消化，離心棄上清，漂洗后離心，加入體積分數(shù)70 %冰乙醇孵育，離心去乙醇并漂洗，用含RNA酶A的PBS緩沖液重新懸浮細胞，加入碘化丙錠1 mL并避光放置30 min，最后上流式細胞儀檢測分析細胞。每組均3個復孔。

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較7株肺腺癌細胞中THBS1 mRNA表達量，3組THBS1 mRNA表達量、吸光度、細胞凋亡率和細胞周期；兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1不同肺腺癌細胞中THBS1mRNA的表達見表1。肺腺癌細胞A549、PC9和Calu3中THBS1 mRNA表達量較高，其中PC9細胞中表達量最高；而H1299、H358、H1975和PG49細胞中THBS1 mRNA表達量較低，其中H1975細胞表達量最低。

表1 不同肺腺癌細胞中THBS1 mRNA的表達量

7組比較，F(xiàn)=104.148，P<0.001；*：與A549細胞相比，P<0.05

2.2pcDNA-THBS1真核表達載體的鑒定從A549細胞中成功擴增出THBS1基因，其大小約為3 500 bp(圖1)。從重組質(zhì)粒pcDNA-THBS1中擴增出500 bp左右的目的片段(圖1)。測序結果表明成功構建了pcDNA-THBS1真核表達載體。

1和3：Marker；2：THBS1的PCR產(chǎn)物；4：pcDNA-THBS1的PCR產(chǎn)物

圖1pcDNA-THBS1的鑒定

2.3轉染pcDNA3.1-THBS1后肺腺癌細胞H1975增殖、凋亡和細胞周期的變化

2.3.1 3組細胞中THBS1 mRNA表達量的比較 見表2。

2.3.2 3組細胞增殖能力的比較 見表2。與空白對照組和pcDNA3.1組相比，pcDNA-THBS1組細胞增殖能力顯著增強。

2.3.3 3組細胞凋亡率的比較 見表3。pcDNA-THBS1組早期細胞凋亡率和總凋亡率低于空白對照組和pcDNA3.1組。

2.3.4 3組細胞周期分布的比較 見表4。 pcDNA-THBS1組G0/G1期細胞比例低于空白對照組和pcDNA3.1組，S期細胞比例大于空白對照組和pcDNA3.1組；3組G2/M期細胞比例差異無統(tǒng)計學差異；提示THBS1表達上調(diào)能促進細胞周期進程。

表2 3組細胞中THBS1 mRNA表達量及吸光度的比較

*：與空白對照組相比，P<0.05；#table_note.1組相比，P<0.05

表3 3組細胞凋亡率的比較 %

*：與空白對照組相比，P<0.05；#：與pcDNA3.1轉染組相比，P<0.05

表4 3組細胞周期的比較 %

*：與空白對照組相比，P<0.05；#：與pcDNA3.1轉染組相比，P<0.05

3 討論

THBS是廣泛分布于多種組織細胞及細胞外基質(zhì)中的分泌性鈣結合糖蛋白，包括THBS1至THBS5共5個成員[5]。THBS呈多模塊結構，每個區(qū)域通過特異性結合不同的因子而發(fā)揮不同的功能，高分辨率測定顯示出其獨特而有趣的蛋白結構。根據(jù)分子結構THBS可分為兩組，其中THBS1和THBS2含有Ⅰ型重復序列TSRs(A組)，其他成員不含有該序列(B組)[6]。TSRs也稱為裂解素重復序列，功能涉及細胞附著、血管生成的抑制、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-黏多糖的相互作用[7]。因此THBS1能夠調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的黏附、遷移與增殖，以及新生血管形成；B組成員缺乏TSRs序列，因此在腫瘤微環(huán)境中不具有抗血管生成作用[5]。

目前人們意識到THBS1不僅僅在血小板聚合和凝固中的發(fā)揮作用[8-9]，THBS1還可影響腫瘤進展；早期階段(休眠)基質(zhì)細胞表達高水平的THBS1，可抑制新生血管形成和腫瘤的生長，晚期階段則促血管因素增加，促進腫瘤生長及侵襲[4,10-13]。

作者利用qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)不同肺腺癌細胞中THBS1 mRNA的表達量不同。研究[14-16]證實前列腺癌、胰腺導管腺癌等腫瘤中THBS1表達下降，而食管鱗狀細胞癌等腫瘤中THBS1表達升高。本研究證實即使在同一種腫瘤的不同細胞系中，THBS1的表達水平也有所不同，這能更好地解釋不同類型腫瘤中THBS1差異表達的問題。作者構建了pcDNA3.1-THBS1真核表達載體并利用脂質(zhì)體轉染入THBS1表達最低的H1975細胞株，細胞中THBS1 mRNA表達明顯上調(diào)，而上調(diào)細胞中的THBS1表達可以增強H1975細胞的增殖，抑制其凋亡并促進細胞周期進程。本研究結果提示THBS1可能與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，這為THBS1作為肺腺癌靶向治療目標的研究奠定了基礎。