豬主動脈瓣膜中NADPH氧化酶2和4的表達

潘亞婷，劉慧兵，王立波，王 蕾，冷小敏，呂 誠，王學惠，趙國安，張 敏

新鄉醫學院第一附屬醫院心內科；新鄉醫學院心血管病診療中心 河南衛輝 453100

鈣化性主動脈瓣膜病(calcific aortic valve disease，CAVD)是僅次于高血壓和冠心病的第三大心血管疾病，嚴重威脅人類健康[1]。主動脈瓣膜主要由瓣膜間質細胞(valvular interstitial cell, VIC)組成，表面覆蓋單層的內皮細胞(endothelial cell, EC)[2]。CAVD是一個主動的、多細胞參與并受復雜調控的成骨樣分化過程。近來有證據[3]表明活性氧(reactive oxygen species, ROS)所介導的氧化還原信號在CAVD中起重要作用。NADPH氧化酶(NADPH oxidases，Nox)是一特殊的產生ROS的酶類家族，它們通過催化電子從NADPH轉移到分子氧而產生超氧陰離子和 H2O2。目前已鑒定出7種亞型(Nox1～5、Duox1～2)。研究[4-5]表明，Nox在幾乎所有的組織細胞中表達，其中心臟和血管主要表達Nox2和Nox4，但二者在多種心血管疾病如心肌肥大和動脈粥樣硬化等中的作用呈現組織細胞特異性。有關Nox在CAVD中的作用目前尚不清楚，甚至缺乏關于Nox在正常主動脈瓣膜組織表達的基本了解。由于豬的心臟及瓣膜結構類似于人類，本研究觀察了Nox2和Nox4在正常豬主動脈瓣膜不同部位(尖、中和根部)的表達水平，并進一步明確了它們在VIC和EC中的表達情況，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1豬主動脈瓣膜組織的獲取與處理健康成年家豬6只(1～2歲，雄性，體重100～150 kg，由新鄉市肉聯屠宰場提供)，處死后立即取出完整的主動脈瓣膜，用無菌冷PBS沖洗后仔細剪下3片主動脈瓣葉并保存于冷PBS中。每片瓣葉分別切取3段(根部、中部和尖部)，標記后立即放入液氮中保存以備后用。豬主動脈瓣膜尖部和根部Nox2、Nox4 mRNA表達的檢測選取家豬6只；豬主動脈瓣膜尖部、中部和根部Nox2、Nox4蛋白表達的檢測，VIC和EC中Nox2、Nox4 mRNA及蛋白表達的檢測選取家豬3只。

1.2EC和VIC的分離、培養及表型鑒定采用膠原酶消化法原代分離、培養EC和VIC[6]。瓣膜剪下后用無菌PBS洗3次，加入6 mL膠原酶消化液(2 g/L)37 ℃孵育8 min，然后用無菌棉簽刮下EC(動作輕柔，以免刮下VIC)，把胰蛋白酶消化液轉移至一15 mL無菌離心管中，然后在消化過的瓣膜中加入冷PBS，輕輕搖動，把PBS也轉移至15 mL離心管中，500g離心3 min，棄去上清，用冷PBS洗1次，相同條件離心后加入2 mL EC培養基(Sciencell公司)重懸后移入培養瓶，再加入6 mL新鮮培養基，置于培養箱中培養。已除去內皮層的瓣膜剪碎后在膠原酶中孵育過夜，次日吹打離心，棄去上清，加入DMEM重懸混勻，種植于培養瓶內。瓣膜細胞用含體積分數10%FBS、青霉素/鏈霉素的高糖DMEM在37 ℃、體積分數5%的CO2細胞培養箱內培養，待細胞生長至約80%融合時開始傳代。取鑒定陽性的2～5代細胞用于實驗。

原代培養的EC和VIC用40 g/L多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗3遍，體積分數0.1% Triton-X 100處理10 min，體積分數5%山羊血清室溫封閉1 h后，1∶100一抗(鼠抗人Vimentin或CD31抗體，分別購于北京博奧森生物技術有限公司和BD Biosciences公司)4 ℃孵育過夜。用PBS漂洗后，1∶150二抗(熒光染料Alexa Flour 488標記的羊抗兔和Alexa Flour 568標記的羊抗鼠IgG抗體，購于北京中杉金橋生物技術有限公司)室溫避光孵育1 h，PBS漂洗，1∶1 000 DRAQ5復染細胞核15 min，用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3豬主動脈瓣膜及VIC和EC中Nox2、Nox4mRNA的qRT-PCR檢測豬主動脈瓣膜剪碎研磨后，加入Trizol提取總RNA。VIC和EC細胞用PBS洗3遍后直接加入Trizol。分光光度計檢測 RNA 濃度及純度。42 ℃2 min；37 ℃15 min，85 ℃5 s，進行反轉錄。引物序列：Nox2上游5’-GTG CACCATGATGAGGAGAA-3’,下游5’-AGTTAGGCCGTCCGTACAAG-3’; Nox4上游5’-GGAACGCACTACCAGGATGT-3’, 下游5’-CAGGTCTGCGGAAAGT TAGC-3’; β-actin上游5’-CCCAAAGCCAACCGT GAG-3’,下游5’-GCCAGAGGCGTACAGGGAC-3’。反應條件：95 ℃變性30 s；95 ℃5 s，60 ℃34 s，40個循環。以β-actin作為內參，采用2-ΔΔCt法計算 Nox2和Nox4 mRNA的相對表達量。

1.4豬主動脈瓣膜及VIC和EC中Nox2、Nox4蛋白的Westernblot檢測分別取豬主動脈瓣膜尖、中、根部，剪碎研磨后加入裂解液提取總蛋白。VIC和EC細胞則直接加入裂解液提取總蛋白。用BCA法進行蛋白定量，SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜。加入一抗Nox2抗體或Nox4抗體(1∶1 000稀釋)孵育過夜；第2天洗膜后再用HRP標記二抗(1∶2 000稀釋)雜交，室溫孵育2 h，洗膜后ECL曝光顯影，利用Image J進行灰度分析，以GAPDH(Protein Tech公司)作為內參。

1.5統計學處理采用SPSS 21.0進行數據分析。豬主動脈VIC和EC中Nox2、Nox4 mRNA及蛋白相對表達量的比較采用兩獨立樣本的t檢驗；豬主動脈瓣膜尖、中、根部Nox2、Nox4蛋白相對表達量的比較，尖部、根部Nox2、Nox4 mRNA相對表達量的比較均采用重復測量數據的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1Nox2和Nox4在豬主動脈瓣膜的表達結果見圖1和表1、2。qRT-PCR檢測結果顯示，Nox2和Nox4 mRNA在瓣膜根部的表達水平高于在尖部的表達。Western blot結果證實，Nox2蛋白在主動脈瓣膜根部表達最高，高于尖部和中部；Nox4蛋白在主動脈瓣膜根部的表達也高于尖部和中部；但Nox2和Nox4蛋白在瓣膜尖部和中部的表達水平比較，差異無統計學意義。

2.2豬主動脈EC和VIC的鑒定結果見圖2。EC緊密排列似鵝卵石或鋪路石樣分布，未見明顯重疊樣生長；EC特異性標識物CD31免疫熒光染色陽性。VIC形態為梭形或紡錘形，排列呈放射狀或漩渦狀，并可互相重疊生長；VIC特異性標識物Vimentin免疫熒光染色陽性。

2.3Nox2和Nox4在豬主動脈EC和VIC中的表達結果見圖3、4和表3、4。EC中Nox4 mRNA和蛋白表達水平均高于VIC，VIC中Nox2蛋白表達水平高于EC，Nox2 mRNA表達水平在兩種細胞中沒有差別。另外，主動脈瓣膜免疫熒光染色顯示，Nox4在瓣膜表面單層EC中高表達，相反，Nox2在VIC中高表達。

圖1 豬主動脈瓣膜尖、中、根部Nox2和Nox4蛋白的表達

組別nNox2Nox4尖部60.74±0.010.39±0.17根部61.07±0.120.88±0.19F組間4.9644.628P0.0010.001

表2 豬主動脈瓣膜尖、中和根部Nox2、Nox4蛋白相對表達量的比較

*：與尖部相比，P<0.05；#：與中部相比，P<0.05

A：EC；B：EC CD31免疫熒光染色；C：VIC；D：VIC Vimentin免疫熒光染色

A:主動脈瓣膜表層EC CD31染色陽性；B:Nox4在主動脈瓣膜表層EC的表達(箭頭所示)；C:Nox2在主動脈VIC的表達(箭頭所示)

圖3EC和VIC中Nox2、Nox4的表達(×200)

圖4 EC和VIC中Nox2、Nox4蛋白的表達

組別nNox2Nox4VIC31.00±0.011.01±0.01EC 30.99±0.0115.97±0.19t0.316189.300P0.768<0.001

表4 VIC和EC中Nox2、Nox4蛋白相對表達量的比較

3 討論

隨著人口的老齡化，退行性瓣膜疾病特別是CAVD成為日益嚴重的問題，然而臨床缺乏有效的藥物防治，因此開展CAVD發病機制研究十分必要。由于豬的心臟及瓣膜結構類似于人類，且標本來源豐富以及瓣膜體積較大，因此原代分離和培養的豬主動脈瓣膜細胞是研究CAVD最常用的材料之一[2]。

ROS和氧化應激損傷在多種疾病中扮演關鍵角色。ROS的病理生理學意義不僅取決于其濃度，而且與其來源、類型、細胞分布及特定氧化還原信號傳導密切相關[7]。與其他ROS來源如線粒體和黃嘌呤氧化酶相比，Nox是細胞內惟一把精確并可控調節低水平ROS作為其主要功能的酶類，因此尤其適合氧化還原信號傳導并參與許多細胞功能包括生長、分化、遷移、增殖和死亡[8]。Nox2和Nox4是人和動物心臟中的主要亞型， Nox2主要受轉錄后調節，參與調控正常和疾病狀態下心臟收縮功能[9]，在由血管緊張素、高血壓或心肌梗死等導致的心肌肥大和心力衰竭中起有害作用[4, 10-11]。相反，Nox4的活性主要由其蛋白表達水平決定，可以通過增加心肌毛細血管的儲備、激活核因子Nrf2、緩解內質網應激以及誘導心肌局部巨噬細胞極化等機制在多種疾病(包括高血壓性心肌肥大和心肌梗死后心力衰竭等)導致的病理性心肌重構過程中起保護作用[5, 12-16]。但Nox在主動脈瓣膜中的生理和病理意義尚不清楚。

本研究證實，正常豬主動脈瓣膜EC和VIC雖然都表達Nox2和Nox4，但Nox4在EC中的水平明顯高于VIC，相反Nox2蛋白在VIC中的水平顯著高于EC，提示這兩種亞型在EC和VIC中起重要但不同的作用。Nox2 mRNA表達水平在兩種細胞中沒有明顯差別，這可能與基因表達的轉錄后調控和修飾不同有關。有資料[17]表明，Nox/ROS在不同細胞間交互應答對病變發展有重要作用。臨床病理顯示，主動脈瓣膜疾病的發生多起始于主動脈瓣膜根部，這可能與主動脈瓣膜不同部位的活動強度和血流剪切力不同有關。有意義的是，作者發現Nox2和Nox4在主動脈瓣膜根部的表達均明顯高于尖部和中部，這種高表達與根部易損之間的相關性提示Nox及其介導的氧化還原信號在瓣膜疾病發生發展中可能具有重要意義，但其具體作用及機制還需要今后進一步深入研究。