透明質酸修飾的中空介孔硫化銅負載阿霉素載藥體系在乳腺癌模型裸鼠體內的分布行為及抗腫瘤效果觀察

賈 欣，馮倩華，張超鋒，王 蕾，王 希，杜 娟

鄭州大學藥學院 鄭州 450001

目前化療是臨床腫瘤治療的重要手段。由于藥物對腫瘤特異性差，腫瘤細胞攝取量較低，且反復、大劑量的多藥聯合應用易產生耐藥性，化療會對全身各組織造成嚴重的不良反應[1-2]。以物理刺激響應的納米材料作為藥物載體，在材料表面修飾靶向分子，可用于制劑的靶向遞送和多機制治療，這為抗腫瘤治療提供了新的策略[3]。近年來，硫化銅納米粒(CuS NPs)作為一種新型的近紅外光(near infrared， NIR)響應型材料，由于其具有光熱穩定性突出和生物相容性良好等優勢，成為當今生物醫藥領域研究的熱點之一[4]。CuS NPs對NIR有很強的局部表面等離子共振效應，也有很強的光熱轉換效率[5]。腫瘤組織局部溫度在短時間內升高達到閾值后，就會引起細胞內蛋白質變性，引發細胞凋亡，故CuS NPs在光熱治療的研究領域中得到迅速發展。其中，中空介孔CuS NPs(hollow mesoporous CuS NPs，HMCuS NPs)的中空空腔和孔道結構均可荷載客體物質，比表面積大，載藥能力強[6]，故可考慮HMCuS NPs作為載體進行化療、熱療的協同治療?？紤]到HMCuS NPs本身對腫瘤部位的選擇性差，靶向效率低，可對HMCuS NPs表面進行修飾。透明質酸(hyaluronic acid，HA)作為內源性黏多糖，具有優良的生物相容性和可降解性，可與大多數腫瘤(如乳腺癌、宮頸癌、膀胱癌等)細胞表面高表達的CD44受體特異性結合，通過CD44受體介導的內吞作用被攝取到腫瘤細胞內[7-9]。故用HA修飾HMCuS NPs負載阿霉素(doxorubicin，DOX)載藥體系(DOX/HMCuS-HA)，有可能提高納米制劑在腫瘤部位的蓄積量，實現光熱治療與化療的協同治療。本研究以荷MCF-7人乳腺癌裸鼠為模型，通過活體成像系統和HE染色等方法考察了DOX/HMCuS-HA的體內分布行為及藥效學特征。

1 材料與方法

1.1材料與儀器鹽酸阿霉素(大連美侖生物科技有限公司)；透明質酸鈉(相對分子質量12 000，山東福瑞達生物醫藥有限公司)；HMCuS NPs(鄭州大學藥學院制備)；DOX/HMCuS-HA[鄭州大學藥學院制備，載藥量為33.6%，粒徑為(113.8±6.9)nm， Zeta電位為(18.4±2.8) mV]；其余試劑均為分析純。

MCF-7細胞(中科院上海生命科學研究院細胞資源中心)； BALB/c 裸鼠，SPF級，雌性，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

808 nm激光儀(長春鐳仕光電科技有限公司)；FX Pro小動物活體成像系統(美國伊士曼柯達醫療集團公司)。

1.2荷MCF-7人乳腺癌裸鼠模型的建立將對數生長期的MCF-7細胞注射于裸鼠右側腋窩皮下，接種量為2×106個/只。使用游標卡尺測量腫瘤長徑和短徑并計算腫瘤體積。小鼠接種腫瘤細胞約7 d后，當腫瘤體積達到100 mm3左右時，認為荷瘤裸鼠模型構建成功。裸鼠喂養于IVC動物房內，清潔級飼料和水均經消毒處理后自由飲食。

1.3制劑體內分布行為的活體成像考察將近紅外熒光染料IR783負載入HMCuS和HMCuS-HA載體中，制備得IR783/HMCuS和IR783/HMCuS-HA。取12只腫瘤體積達到500～1 000 mm3的荷瘤裸鼠，采用隨機數字表法分為4組(n=3)，分別通過尾靜脈注射生理鹽水、IR783、IR783/HMCuS和IR783/HMCuS-HA(100 μg IR783/kg)。之后將裸鼠與呼吸麻醉機連接，異氟醚吸入濃度調為體積分數2%，氧流量為2 L/min，維持裸鼠麻醉。在預定時間點(給藥后1、3、6、8、12 和24 h)使用小動物活體成像系統對裸鼠進行信號采集(770 nm激光激發和830 nm濾光片過濾)。給藥24 h后脫頸處死小鼠，取心、肝、脾、肺、腎、腫瘤等組織進行離體近紅外熒光成像并記錄熒光強度。

1.4體內抗腫瘤活性觀察取60只腫瘤體積在100 mm3左右且體重接近的荷瘤裸鼠，采用隨機數字表法分為10組(n=6)：生理鹽水組、生理鹽水+NIR組、HMCuS-HA組、HMCuS-HA+NIR組、DOX組、DOX+NIR組、DOX/HMCuS組、DOX/HMCuS+NIR組、DOX/HMCuS-HA組、DOX/HMCuS-HA+NIR組。采取尾靜脈注射方式給藥，DOX和HMCuS的給藥劑量分別為5 mg/kg和8 mg/kg，每2 d給藥一次，共給藥6次。NIR組在給藥8 h后使用808 nm激光照射腫瘤部位(2 W/cm2，3 min)。整個實驗過程中保證小鼠每日正常飲食，隔天測量并繪制各組相對瘤體積(V/V0)隨時間的變化曲線。實驗結束后脫頸處死小鼠，取腫瘤組織稱重，計算抑瘤率。抑瘤率=[(生理鹽水組腫瘤質量-給藥組腫瘤質量)/生理鹽水組腫瘤質量]×100%。

1.5腫瘤組織HE染色觀察將1.4項下的腫瘤組織放入甲醛溶液中浸泡固定，常規石蠟包埋，切片后進行HE染色，光學顯微鏡下觀察組織的形態學變化。

1.6制劑的體內安全性評估在1.4項下的體內抗腫瘤活性研究過程中監測荷瘤裸鼠生存狀態及體重變化，繪制體重隨時間的變化曲線。實驗結束后取心臟組織，固定后石蠟包埋、切片，進行HE染色，于光學顯微鏡下觀察心臟組織的形態學變化。

1.7統計學處理采用SPSS 18.0進行統計學處理。給藥24 h 后各組臟器中IR783熒光強度的比較采用重復測量數據的方差分析；不同組間抑瘤率的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1制劑體內分布行為的活體成像考察結果見圖1、表1?？芍?，給藥后3 h內各組均在裸鼠全身檢測到熒光信號；隨時間延長，IR783組的熒光信號逐漸減弱，給藥12 h后已幾乎觀察不到熒光信號；而IR783/HMCuS和IR783/HMCuS-HA組在給藥24 h后仍可以檢測到熒光信號。給藥后，IR783/HMCuS-HA組腫瘤部位的熒光強度遠高于IR783/HMCuS組和IR783組，且在腫瘤部位的熒光強度均高于其他組織。

上：荷瘤裸鼠給藥后不同時間點的成像圖；下：給藥24 h后各臟器的成像圖。a：生理鹽水組；b：IR783組；c：IR783/HMCuS組；d：IR783/HMCuS-HA組

圖1近紅外熒光活體成像結果

表1給藥24h后各組裸鼠臟器及腫瘤組織中IR783的熒光強度比較(n=3)

組別心 肝 脾 肺 腎 腫瘤 IR783組252±12338±25162±8289±15408±61477±42IR783/HMCuS組274±14411±22*145±14347±25*466±451 125±80*IR783/HMCuS-HA組406±11*#514±28*#112±13*#421±36*#703±64*#1 550±121*#

F組間=189.903，P<0.001；F組織=423.331，P<0.001；F交互=58.644，P<0.001；*：與IR783組比較，P<0.05；#：與IR783/HMCuS組比較，P<0.05

2.2體內抗腫瘤活性結果見圖2、表2。

圖2 各組荷瘤裸鼠相對瘤體積變化曲線

組別抑瘤率/%生理鹽水+NIR組3.97±0.58HMCuS-HA組3.35±0.63HMCuS-HA+NIR組25.41±1.67* DOX組43.96±3.98*DOX+NIR組45.58±5.26*DOX/HMCuS組52.04±5.74*DOX/HMCuS+NIR組73.20±7.68*DOX/HMCuS-HA組67.64±6.50*DOX/HMCuS-HA+NIR組88.87±6.14*

F=109.235，P<0.001；*：與生理鹽水+NIR組比較，P<0.05

2.3腫瘤組織病理學檢查結果見圖3。

圖3 各組腫瘤組織HE染色結果

在無NIR照射時，生理鹽水組和HMCuS-HA組均顯示出經典的病理特征，表現為細胞排列緊密、形態完整、胞漿豐富、染色清晰。而其他各組則在不同程度上出現了細胞排列稀疏、細胞核皺縮、核膜溶解等凋亡和壞死情況。

2.4制劑的體內安全性評估結果見圖4、5?？芍?，除DOX組裸鼠體重增長較為緩慢外，其余各組的體重均正常增長，而且在給藥期間裸鼠的精神狀態良好。DOX組裸鼠的心臟組織中發現了心肌纖維斷裂和細胞核聚集的情況。而DOX/HMCuS-HA組裸鼠的各臟器均未觀察到病理學損傷。

圖4 各組荷瘤裸鼠體重變化曲線

A：HMCuS-HA組；B：DOX組；C：DOX/HMCuS-HA+NIR組；箭頭處為心肌纖維斷裂和細胞核聚集

3 討論

化療藥物DOX對腫瘤特異性差，且易產生耐藥性，降低了治療指數。納米藥物遞送系統以其腫瘤定位、高效低毒、緩控釋放藥物的優勢在臨床應用中具有很大的潛力，目前已成為腫瘤的預防、診斷、治療和監控研究的熱點。該研究中作者用NIR響應型HMCuS NPs負載DOX并用HA 修飾，得到DOX/HMCuS-HA。近紅外熒光活體成像實驗中發現IR783通過血循環到達腎臟快速代謝。而IR783/HMCuS-HA則選擇性地聚集在腫瘤部位，推測是由于納米粒延長了客體分子在體內的血循環時間并通過納米粒本身對實體瘤的高通透性、滯留效應和HA的主動靶向作用增強了在腫瘤部位的蓄積，具有優異的腫瘤靶向性[10]。在此，HA配體作為一種主動靶頭與乳腺癌細胞表面高表達的CD44受體特異性結合，通過CD44受體介導的內吞作用被癌細胞攝取。另外，納米載體組較游離的IR783組在肝臟和肺組織的熒光信號強，推測是該納米顆粒容易被肝臟和肺等內皮網狀系統的巨噬細胞吞噬而滯留導致[11-12]。

相對瘤體積、抑瘤率、腫瘤HE染色結果均表明DOX/HMCuS-HA在NIR照射下表現出較優異的治療效果。一方面，DOX/HMCuS-HA的長循環特征和腫瘤靶向性促進了制劑在腫瘤部位的蓄積；另一方面，HMCuS的光熱治療與DOX的化療聯合應用極大提高了治療效果。

得益于HMCuS-HA的腫瘤靶向性，DOX/HMCuS-HA制劑在給藥后相對減少了在其他正常組織的分布，病理結果表明其可減少DOX對正常組織的不良反應。據文獻[13-14]報道，HMCuS NPs在體內可降解為7～12 nm的納米單晶，之后可通過腎臟排出體外，在體內研究中未觀察到明顯的慢性毒性和急性毒性。實驗中HMCuS-HA組的各臟器均無病理學異常改變，證明HMCuS-HA載體具有良好的生物安全性。

綜上所述，DOX/HMCuS-HA具有優異的乳腺癌腫瘤靶向性，實現了腫瘤靶向的光熱治療與化療的協同治療，具有明顯的抗腫瘤效果，為腫瘤的安全有效治療開拓了新的途徑。