shRNA介導的波形蛋白基因沉默對肝癌細胞遷移、侵襲能力的影響

柳 嚴，張德林，王國良，趙鵬偉，黃建釗

貴州省人民醫(yī)院肝膽外科 貴陽 550002

原發(fā)性肝癌是一種常見的起源于肝臟上皮或間葉組織的消化道惡性腫瘤，具有發(fā)病隱匿、進展快和早期診斷困難等特點，其發(fā)病率和病死率一直居高不下，且有升高的趨勢，嚴重威脅著人類的生命安全[1-2]。其中，浸潤轉移是導致肝癌患者死亡加速和手術治療成功率低的重要原因。因此，尋找能夠阻斷肝癌細胞浸潤和轉移的有效分子靶點，一直是肝癌領域研究的熱點問題。波形蛋白(Vimentin)是一種中間絲蛋白，廣泛表達于正常的間質細胞，與上皮間質轉化關系密切。研究[3-6]發(fā)現，Vimentin在宮頸癌、口腔癌和乳腺癌等多種腫瘤中異常高表達，與腫瘤的轉移密切相關；干擾或沉默Vimentin表達，可抑制腫瘤的轉移。近年來，有研究[7]指出Vimentin在肝癌組織中高表達，與腫瘤的病理分級和遠處轉移等有關，但其具體的作用機制不詳。本研究構建了靶向Vimentin基因的慢病毒LV-Vimentin-GFP-shRNA，感染肝癌Huh7細胞，建立Vimentin基因穩(wěn)定沉默的Huh7細胞，觀察沉默Vimentin表達對Huh7細胞遷移和侵襲能力的影響，并探討其可能的分子機制，以期為肝癌的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1材料、試劑和儀器肝癌Huh7細胞購于中國科學院上海細胞庫。pLVTHM載體購于上海吉凱公司。Trizol試劑購于美國Invitrogen公司，胎牛血清購于美國Sigma公司，RPMI 1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶購于美國Gibco公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購于北京索萊寶科技公司，反轉錄試劑盒購于日本TaKaRa公司，β-actin抗體、MMP-9抗體和受體酪氨酸激酶(AXL)抗體購于美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標記的二抗購于美國Zymed公司。PVDF膜購于美國Millpore公司，Matrigel膠購于美國BD公司，凝膠成像系統(tǒng)購于美國Bio-Rad公司，紫外分光光度儀和CO2培養(yǎng)箱購于法國Jouan公司，電泳儀購于北京六一儀器廠。

1.2細胞培養(yǎng)、分組和慢病毒感染將Huh7細胞和293T細胞解凍復蘇后，以含有體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基于95%飽和濕度、體積分數5%CO2和37 ℃的無菌培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每3 d以2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代，收集生長良好的第5代細胞進行實驗。Vimentin特異性干擾序列5’-GGATGTTGACAATGCGTCT-3’由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，將目的片段插入pLVTHM載體的MluⅠ和ClaⅠ位點，H1啟動子和EF1-α啟動子分別調控siRNA和GFP表達，構建陰性對照質粒LV-NC-GFP-shRNA和干擾質粒LV-Vimentin-GFP-shRNA，并經陽性克隆篩選和鑒定。取對數生長期的293T細胞，調整細胞密度，將2×105個細胞接種于培養(yǎng)瓶中。嚴格參照慢病毒包裝使用說明書包裝293T細胞，以MOI=5時的感染效率最高，慢病毒滴度達到3×106TU/mL。感染前，將對數生長期的Huh7細胞以每孔3×104個細胞接種至6孔板上，于培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)。待Huh7細胞達到50%左右融合時，將細胞分為對照組(未感染細胞)、陰性對照組(以LV-NC-GFP-shRNA感染細胞)和實驗組(以LV-Vimentin-GFP-shRNA質粒感染細胞)，給予相應處理。感染時，加入8 mg/L凝膠胺(按照MOI=5)強化感染效果，感染72 h后，顯微鏡下觀察熒光。感染效率=綠色熒光細胞/視野內細胞數×100%。以4 mg/L耐嘌呤霉素進行藥物篩選，15 d后觀察細胞克隆，挑選單克隆集落，擴大細胞培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定細胞。

1.3 3組細胞中VimentinmRNA檢測收集對照組、陰性對照組和實驗組細胞，參照Trizol試劑說明提取總RNA，并以分光光度計對其濃度和純度進行定量。采用反轉錄試劑盒合成cDNA，再以cDNA為模板，上PCR儀進行擴增。Vimentin上游引物5’-AGAGAACTTTGCCGTTGAAGC-3’，下游引物5’-ACGAAGGTGACGAGCCATT-3’；內參β-actin上游引物5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，下游引物5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’。反應條件：預變性95 ℃2 min；變性95 ℃15 s，退火延伸60 ℃30 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算Vimentin mRNA的相對表達量。實驗重復3次。

1.4 3組細胞遷移和侵襲能力檢測細胞遷移實驗：將收集到的對照組、陰性對照組和實驗組細胞饑餓處理1 d，以胰蛋白酶消化，制備細胞懸液，按2×105個/mL接種200 μL于Transwell小室的上室中。同時，于下室中加入含有胎牛血清的培養(yǎng)基500 μL，放入細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，48 h后取膜，擦去上室中沒有遷移的細胞，先后加入甲醛(40 g/L)和結晶紫(5 g/L)進行固定(10 min)和染色(30 min)。洗滌晾干后，以光學顯微鏡觀察穿膜細胞數。每次觀察時選取5個視野，每組觀察3次。細胞侵襲實驗：首先用人工基底膜膠對Transwell小室的多聚碳酸酯膜進行包被，其余步驟與細胞遷移實驗相同。實驗重復3次。

1.5 3組細胞中Vimentin、MMP-9和AXL蛋白檢測采用Western blot方法。收集對照組、陰性對照組和實驗組細胞，離心后，加入細胞裂解液提取總蛋白，并采用BCA法對所提總蛋白進行定量。取蛋白樣品60 μg上樣至100 g/L SDS-PAGE凝膠中，以80 V電壓電泳分離2 h后，再以250 mA電流轉PVDF膜90 min。接著，浸入到含脫脂奶粉(50 g/L)的封閉液中反應2 h。經TBST漂洗后，加入1∶800稀釋的Vimentin抗體或1∶1 000稀釋的MMP-9抗體、AXL抗體、β-actin抗體，于4 ℃條件下孵育過夜。再經TBST漂洗后，加入1∶5 000稀釋的二抗，常溫下孵育1.5 h。加化學發(fā)光劑暗室中顯影曝光，以凝膠成像系統(tǒng)和Image J軟件對目的蛋白進行分析，目的蛋白的相對表達水平=目的蛋白條帶的灰度值/內參β-actin條帶的灰度值。實驗重復3次。

1.6統(tǒng)計學處理采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學分析。3組間Vimentin mRNA和Vimentin、MMP-9、AXL蛋白表達水平，遷移細胞數和侵襲細胞數的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1慢病毒對Huh7細胞的感染效率LV-Vimentin-GFP-shRNA對Huh細胞的感染效率為(82.65±2.25)%，LV-NC-GFP-shRNA為(79.45±1.36)%。

2.2 3組Huh7細胞中Vimentin的表達結果顯示，實驗組細胞中Vimentin mRNA、蛋白的表達水平

較2個對照組下降，而陰性對照組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。見圖1和表1。

圖1 各組Huh7細胞中Vimentin蛋白的表達

組別nVimentin mRNAVimentin 蛋白對照組31.00±0.080.62±0.05陰性對照組30.96±0.050.53±0.07實驗組30.32±0.03*0.11±0.02*F133.71485.500P<0.001<0.001

*：與其他2組相比，P<0.05

2.3 3組Huh7細胞的遷移和侵襲能力比較對照組與陰性對照組遷移和侵襲細胞數比較，差異均無統(tǒng)計學意義；而實驗組遷移和侵襲細胞數較2個對照組明顯減少。見表2。

表2各組Huh7細胞遷移和侵襲細胞數比較

組別n遷移細胞數侵襲細胞數對照組3355.50±10.0092.00±6.50陰性對照組3346.00±12.5086.00±8.00實驗組3124.50±5.50*37.50±4.50*F536.72063.540P<0.001<0.001

*：與其他2組相比，P<0.05

2.4 3組Huh7細胞中MMP-9和AXL蛋白的表達陰性對照組中兩種蛋白的表達水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，但實驗組中兩種蛋白的表達水平較2個對照組均明顯降低。見圖2和表3。

圖2 各組Huh7細胞中MMP-9和AXL蛋白的表達

組別nMMP-9AXL對照組30.85±0.050.37±0.02陰性對照組30.88±0.060.40±0.05實驗組30.49±0.03*0.28±0.01*F60.557 11.700P<0.001 0.009

*：與其他2組相比，P<0.05

3 討論

中間絲是與細胞運動密切相關的細胞骨架的重要成分，而Vimentin作為中間絲蛋白也逐漸引起學術界的關注。隨著研究的深入，Vimentin被認為與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切，特別是在腫瘤細胞的上皮間質轉化過程中扮演著重要角色[8]。Ye等[9]和Tadokoro等[10]研究指出，Vimentin在非小細胞肺癌高表達，與腫瘤分期、淋巴結轉移和預后不良等關系密切，且Vimentin沉默能夠降低癌細胞的侵襲能力。Wang等[11]也發(fā)現，Vimentin在鼻咽癌中高表達，體外沉默鼻咽癌CNE2細胞中Vimentin表達可抑制癌細胞的遷移和侵襲。近年來，國內研究[7]發(fā)現，Vimentin在肝癌組織中也呈現高表達，并與腫瘤的病理分級和遠處轉移等有關，提示其可能在肝癌的侵襲和轉移過程中發(fā)揮重要作用。為了明確Vimentin在肝癌細胞遷移和侵襲中的作用，作者構建了靶向Vimentin基因的慢病毒LV-Vimentin-GFP-shRNA，以其感染肝癌Huh7細胞，感染效率達到(82.65±2.25)%，表明成功建立了Vimentin基因穩(wěn)定沉默的Huh7細胞，該細胞遷移和侵襲能力均明顯下降，表明沉默Vimentin基因可抑制肝癌Huh7細胞的遷移和侵襲。這一實驗結果與卓少元等[12]發(fā)現健脾益氣方含藥血清可通過下調肝癌細胞中Vimentin表達抑制肝癌細胞侵襲的結論相吻合。

MMP-9是MMP家族的重要一員，也是一種Ⅳ型膠原酶，可通過調控層粘連蛋白、纖維粘連蛋白和細胞因子等多種底物，發(fā)揮降解和重塑細胞外基質動態(tài)平衡的作用，與包括肝癌在內的多種腫瘤的侵襲和轉移過程關系密切[13]。AXL是一種存在于細胞表面的跨膜蛋白，屬于受體型酪氨酸激酶亞家族，可通過與配體結合而被激活，從而對下游基因或信號通路發(fā)揮調控作用，參與肝癌細胞轉移[14]。盧冠軍等[15]研究指出，Vimentin上調可通過增強MMP-9的表達促進膀胱癌SW780細胞的侵襲。Vuoriluoto等[16]發(fā)現，Vimentin表達有助于乳腺癌的上皮-間質轉化，在乳腺上皮細胞中沉默Vimentin表達可通過下調AXL影響細胞的侵襲能力。本研究采用Western blot法進一步檢測發(fā)現，Vimentin基因沉默可明顯減弱Huh7細胞中MMP-9和AXL蛋白的表達。提示，在肝癌Huh7細胞中，沉默Vimentin基因可通過下調MMP-9和AXL的表達抑制細胞的遷移和侵襲。

綜上所述，Vimentin基因與肝癌的發(fā)展密切相關，沉默其表達可能通過下調MMP-9和AXL表達抑制肝癌Huh7細胞的遷移和侵襲。本研究進一步豐富了肝癌發(fā)生轉移的分子機制，也為肝癌的治療提供了新的靶點和線索[17-18]。