轉染DNMT1 siRNA對瘢痕疙瘩成纖維細胞生長的影響

杜 萍，侯圣光，張良文，谷興華

1)濰坊市益都中心醫院醫學美容科 山東濰坊 262500 2)濰坊市益都中心醫院藥劑科 山東濰坊 262500 3)齊魯醫院神經外科 濟南 250000 4)齊魯醫院心外科 濟南 250000

瘢痕疙瘩又稱疤痕疙瘩，是一種常見的皮膚纖維組織異常增生疾病，主要臨床表現有瘙癢、局部增生和刺痛等，且有一定的遺傳傾向。目前關于瘢痕疙瘩的治療主要有手術切除、放療和藥物治療等，但治療效果不十分理想。瘢痕疙瘩的形成是一個復雜的過程，效應細胞——成纖維細胞一直是瘢痕疙瘩研究的熱點。DNA甲基化與生物的整個生理過程密切相關，不僅參與了腫瘤的發展，還參與了多種纖維化和增生性疾病的發生[1-2]。DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase，DNMT)家族在催化和維持DNA甲基化過程中發揮著重要作用，DNMT1是DNMTs家族中的重要成員之一，在多種疾病中異常表達，參與細胞生理過程[3]。本研究觀察了干預瘢痕疙瘩成纖維細胞中DNMT1的表達對細胞生長的影響，并探討其可能的分子機制，以期為瘢痕疙瘩的治療提供線索和依據。

1 材料與方法

1.1標本來源收集濰坊市益都中心醫院醫學美容科手術切除的15例瘢痕疙瘩標本(男6例，女9例；年齡12～41歲)；取材部位：面部3例，胸背部5例，腹部3例，四肢4例；病程3～20個月；手術所致5例，感染所致2例，外傷所致6例，穿耳孔所致2例；患者均無結締組織病和合并皮膚疾病等，局部皮膚無潰瘍和感染。另取10例需要植皮患者的正常皮膚樣本作為正常對照。所有標本收集前患者均知情并同意，且經組織學檢查(HE染色切片)證實。

1.2試劑與儀器DMEM培養基(美國Hyclone公司)，轉染試劑LipofectaminTM2000(美國Invitrogen公司)，DNMT1 siRNA、陰性對照siRNA(美國Thermo公司)。DNMT1抗體、GAPDH抗體、辣根過氧化酶標記的二抗(美國Santa Cruz公司)，BCA蛋白檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)。MTT試劑(美國Sigma公司)，qRT-PCR試劑盒(美國Qiagen公司)，Trizol試劑。PCR儀和凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)，凝膠電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.3細胞培養采用組織塊貼壁法[4]獲得瘢痕疙瘩成纖維細胞和正常皮膚細胞，用含有體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基中于體積分數5%CO2、37 ℃條件下培養。收集生長狀態良好的第5代對數生長期細胞進行實驗。參考徐永飛等[5]的方法，在倒置顯微鏡下觀察，以免疫細胞化學法檢測細胞中CD73、CD90和CD105均為陽性且表達率較高時，即為所需細胞。當細胞純度達98%以上，進行后續實驗。

1.4正常皮膚細胞和疤痕疙瘩成纖維細胞中DNMT1mRNA和蛋白的表達

1.4.1 qRT-PCR 向正常皮膚細胞和瘢痕疙瘩成纖維細胞中加入Trizol試劑以提取總RNA，以反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄合成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增。DNMT1上游引物序列5’-AGAACGGTGCTCATGCTTACA-3’，下游引物序列5’-CTCTACGGGCTTCACTTCTTG-3’；內參GAPDH上游引物序列5’-GAGCCAAAAGGGTCATCATCTC-3’，下游引物序列5’-AAAGGTGGAGGAGTGGGT GTC-3’。擴增條件：95 ℃ 10 s；95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共32個循環；72 ℃ 60 s。采用2-ΔΔCt法計算DNMT1 mRNA的相對表達量。

1.4.2 Western blot 向正常皮膚細胞和瘢痕疙瘩成纖維細胞中加入裂解液提取總蛋白，以BCA法對其定量。向總蛋白中加入等量的上樣緩沖液后，于沸水浴中反應5 min。經SDS-PAGE電泳、電轉儀轉膜和封閉液(含50 g/L脫脂奶粉液)封閉后，加入DNMT1抗體(按1∶800稀釋)和GAPDH抗體(按1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜。次日洗膜后，加入二抗常溫孵育2 h。滴加化學發光劑顯色，凝膠成像系統掃描分析。

1.5干擾DNMT1表達對疤痕疙瘩成纖維細胞增殖、凋亡及基因表達的影響

1.5.1 分組 取96孔細胞板，以每孔5×104個瘢痕疙瘩成纖維細胞進行接種，將細胞隨機分為對照組、陰性對照siRNA轉染組(siRNA NC組)和DNMT1 siRNA轉染組(siRNA DNMT1組)，每組設置3個復孔。次日，根據LipofectaminTM2000說明書將終濃度為40 nmol/L的陰性對照siRNA或DNMT1 siRNA轉染至細胞中，轉染后6 h更換為完全培養基繼續培養48 h，收集細胞，參照1.4方法檢測3組DNMT1 mRNA和蛋白的表達情況。

1.5.2 細胞增殖檢測 取96孔細胞板，以每孔細胞懸液100 μL(細胞濃度2×105個/mL)進行種植，在體積分數5%CO2、37 ℃的細胞培養箱中培養，以1.5.1中的實驗分組和轉染方法處理細胞。分別在轉染1、2和3 d后，加20 μL MTT溶液(5 g/L)。反應4 h后，加DMSO 150 μL，振蕩，待結晶充分溶解后，以酶標儀檢測490 nm波長處的吸光度值。

1.5.3 細胞凋亡檢測 取96孔板，接種細胞懸液100 μL(濃度2×105個/mL)，實驗分組及處理同1.5.1。在轉染48 h后，離心棄上清，并以磷酸鹽緩沖液洗滌細胞。根據凋亡檢測試劑盒使用說明書的操作步驟先加入結合緩沖液500 μL，再加入Annexin V-FITC和PI各5 μL進行雙染色。于避光條件下充分反應后，上流式細胞儀檢測。

1.5.4 細胞中PCNA、Bcl-2、Bax和TGF-β1 mRNA檢測 收集3組細胞，加Trizol試劑提取總RNA后，反轉錄合成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增。PCNA上游引物序列5’-TCCCTTACG CAAGTCTCAGC-3’，下游引物序列5’-GTCCTT GAGTGCCTCCAACA-3’；Bcl-2上游引物序列5’-TGGGATGCCTTTGTGGAACTAT-3’，下游引物序列5’-GCTGATTTGACCATTTGCCTGA-3’；Bax上游引物序列5’-CCCCCGAGAGGTCATCGTCCG-3’，下游引物序列5’-GGGCCTTGAGCACCAGTTTG-C-3’；TGF-β1上游引物序列5’-CTAATGGTGGAAACCCA CAACG-3’，下游引物序列5’-TATCGCCAGGAATT GTTGCTG-3’。具體實驗步驟參照1.4。

1.6統計學處理采用SPSS 20.0進行分析，應用兩獨立樣本t檢驗比較瘢痕疙瘩成纖維細胞和正常皮膚細胞中DNMT1 mRNA和蛋白表達的差異，應用單因素方差分析比較3組瘢痕疙瘩成纖維細胞DNMT1 mRNA和蛋白、增殖、凋亡及PCNA、Bcl-2、Bax、TGF-β1 mRNA表達的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1DNMT1在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達及DNMT1siRNA干擾的效果qRT-PCR檢測結果(圖1A)顯示，瘢痕疙瘩成纖維細胞中DNMT1 mRNA相對表達水平高于正常皮膚細胞[(5.26±0.58)vs(1.01±0.12),t=12.429，P<0.001]，DNMT1蛋白表達水平亦高于正常皮膚細胞[(0.86±0.07)vs(0.25±0.02)，t=14.513，P<0.001]。轉染48 h后，siRNA DNMT1組瘢痕疙瘩成纖維細胞中DNMT1 mRNA和蛋白的表達低于對照組和siRNA NC組，見圖1B和表1。

A：DNMT1在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達；B：DNMT1 siRNA的干擾效果

圖1 qRT-PCT電泳和Western blot檢測結果

*：與對照組和siRNA NC組相比，P<0.05

2.2 3組瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖能力的比較見表2。

表2 3組瘢痕疙瘩成纖維細胞的吸光度值

*：與對照組和siRNA NC組相比，P<0.05

2.3 3組瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡率的比較siRNA DNMT1組細胞凋亡率(23.22±2.75)%較對照組(9.25±0.82)%和 siRNA NC組(10.18±1.06)%升高(F=58.674，P<0.001)。

2.4 3組瘢痕疙瘩成纖維細胞中PCNA、Bcl-2、Bax和TGF-β1mRNA表達的比較見表3。siRNA DNMT1組細胞中PCNA、Bcl-2和TGF-β1 mRNA的表達水平低于其他2組，而Bax mRNA表達水平高于其他2組(P<0.05)。

表3 3組瘢痕疙瘩成纖維細胞中PCNA、

Bcl-2、Bax、TGF-β1mRNA的相對表達量(n=3)

組別PCNA mRNABcl-2 mRNABax mRNATGF-β1 mRNA對照組1.00±0.090.96±0.051.02±0.061.01±0.08siRNA NC組0.93±0.060.89±0.080.98±0.050.95±0.07siRNA DNMT1組0.71±0.06*0.55±0.03*1.42±0.05*0.67±0.05*F13.47144.17461.95421.478P<0.001<0.001<0.001<0.001

*：與對照組和siRNA NC組相比，P<0.05

3 討論

DNA甲基化貫穿了機體胚胎發育、衰老和腫瘤發生等生理、病理過程，其介導的表觀遺傳修飾在調控基因表達方面具有重要作用，與多種疾病的發生關系密切。DNA甲基化受DNMTs的調控，DNMT1是DNMTs家族研究較多的一個成員。趙淑磊等[6]指出，DNMT1在食管鱗狀細胞癌組織中的表達水平高于癌旁正常組織，沉默其表達后，可抑制KYSE30細胞的增殖，并促進細胞凋亡。DNMT1除了參與腫瘤細胞的增殖、凋亡過程外，還在纖維化疾病的發生發展中扮演著重要角色。Bian等[7]發現，DNMT1可通過調控TGF-β1改善Smad7的表達，進而參與大鼠肝星狀細胞活化與肝纖維化過程。繆成貴等[8]研究指出，在類風濕性關節炎大鼠滑膜成纖維樣滑膜細胞(FLS)中DNMT1表達顯著升高，抑制其表達后，FLS細胞增殖能力減弱，抗凋亡基因Bcl-2表達下降，引發FLS細胞凋亡增強。瘢痕疙瘩是一種體表纖維化性疾病，在創傷后傷口愈合的修復過程中，成纖維細胞的過度增生是導致瘢痕疙瘩形成的重要原因之一。Yang等[9]指出，DNMT1與瘢痕疙瘩浸潤生長密切相關。因此，推測DNMT1在成纖維細胞生長過程中可能發揮著重要作用，研究DNMT1在成纖維細胞增殖、凋亡中的作用對認識和治療瘢痕疙瘩具有重要意義。

本研究從瘢痕疙瘩標本中分離、培養得到瘢痕疙瘩成纖維細胞，以qRT-PCR檢測確認DNMT1在細胞中高表達。然后用DNMT1 siRNA干擾瘢痕疙瘩成纖維細胞中DNMT1表達，結果顯示，下調DNMT1表達后，瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖能力減弱，而凋亡能力增強，這一結果也進一步印證了甲基化酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷抑制人瘢痕疙瘩成纖維細胞生長的結論[10]；提示，在瘢痕疙瘩的發生發展中，DNMT1可能扮演著促進成纖維細胞增殖和抑制細胞凋亡的作用。PCNA是細胞增殖中廣泛存在的核抗原，在DNA的復制和修復、染色體的組裝以及細胞周期中具有重要的調控作用，與瘢痕疙瘩的浸潤性生長關系密切[11-12]。Bcl-2是抑凋亡基因，Bax是促凋亡基因，兩者在瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡過程中發揮著重要的調控作用[11]。TGF-β1是TGF-β家族中最活躍的一員，不僅在成纖維細胞分裂增殖中發揮著促進作用，還可促進成纖維細胞中膠原的合成，使細胞外基質大量沉積，促進瘢痕疙瘩的發生[13-14]。本研究通過qRT-PCR檢測轉染DNMT1 siRNA后瘢痕疙瘩成纖維細胞中PCNA、Bcl-2、Bax和TGF-β1 mRNA的表達。結果顯示，siRNA DNMT1組細胞中PCNA、Bcl-2和TGF-β1 mRNA表達水平均明顯下降，而Bax mRNA表達水平明顯升高。提示，DNMT1可能通過上調PCNA、Bcl-2、TGF-β1和下調Bax基因表達促進了瘢痕疙瘩成纖維細胞生長。

綜上所述，DNMT1在瘢痕疙瘩成纖維細胞中高表達，干擾其表達能夠明顯抑制細胞的增殖，促進細胞凋亡，其作用機制可能與上調Bax和下調PCNA、Bcl-2、TGF-β1表達有關。該實驗結果為以DNMT1為靶點的瘢痕疙瘩靶向治療提供了理論依據。